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目的:制备叶酸修饰的3-溴丙酮酸脂质立方液晶纳米粒(Folic Acid Modification of3-bromopyruvate Liquid Crystalline Nanoparticles,3BP-LCNP-FA)并对3BP-LCNP-FA进行处方筛选及制备工艺优化后,考察粒径及形态;通过模拟肿瘤微环境p H 6.8考察3BP-LCNP-FA的体外累积释药特性;通过体外培养肿瘤细胞考察不同药物剂型对细胞的增殖抑制作用及对细胞内ATP水平的影响;通过建立荷瘤裸鼠模型,考察3BP-LCNP-FA的体内抗肿瘤效果及毒副作用。方法:1.筛选3BP-LCNP最优处方及最佳制备工艺:采用注入法联合高压均质法制备3BP-LCNP,通过正交试验设计以液晶形成的晶型类别和包封率为指标,筛选辅料甘油单油酸酯(GMO)、稳定剂泊洛沙姆407(F127)、分散相纯水的用量及搅拌时间,确定最佳制剂处方。通过单因素实验考察均质次数及均质压力对3BP-LCNP平均粒径及包封率的影响。通过偏光显微镜(PLM)观察不同处方比例下晶型的状态。应用马尔文粒度仪测量3BP-LCNP的平均粒径分布。2.叶酸(FA)与泊洛沙姆407(F127)的连接(FA-F127)及3BP-LCNP-FA的制备和表征:使用差示扫描量热法(DSC)及核磁共振氢谱(1H-NMR)评估叶酸与泊洛沙姆407的连接;制备3BP-LCNP-FA,并对3BP-LCNP-FA进行表征,通过PLM观察3BP-LCNP及3BP-LCNP-FA的晶型,马尔文粒度仪观察3BP-LCNP-FA粒径分布;通过冷冻透射电镜观察3BP-LCNP-FA纳米粒子形态;采用平衡透析法测定3BP-LCNP-FA的包封率。3.3BP-LCNP-FA的体外累积释放及对肿瘤细胞的作用,以p H 6.8的磷酸盐缓冲液为释放介质,采用平衡透析法考察3BP-LCNP-FA的体外累积释放度;活细胞工作站观察不同药物剂型作用于MCT1高表达的CNE2Z和MCT1低表达的MDA-MB-231细胞,观察细胞的形态及密度变化;采用MTT法考察LCNP-FA、3BP、3BP-LCNP、3BP-LCNP-FA对CNE2Z和MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用;通过ATP试剂盒检测不同药物剂型作用后,细胞内ATP水平的变化。4.3BP-LCNP-FA体内药效学评估,建立荷瘤裸鼠模型,通过给药期间肿瘤体积及裸鼠体重变化趋势和最终瘤体积、瘤重评估不同药物剂型对肿瘤的抑制作用及不良反应;通过H&E切片分析不同药物剂型对肿瘤组织、肺、肝、肾的影响;通过分析血清中肝肾组织损伤标志物谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的水平考察不同药物剂型对肝肾的影响;最后对肿瘤组织进行PCNA免疫组化及Tunel检测肿瘤组织中细胞的增值及凋亡状态。结果:1.注入法联合高压均质法制备的最优处方为:GMO与F127的浓度比为8:1(总质量保持在1 g)即GMO 0.889 g,F127 0.111 g,纯水25 m L,3BP 26.67mg,搅拌20 min,。制备的液晶在偏光显微镜下显示为暗视野,表明制备的液晶为立方相液晶。优化后的制备工艺为14900 psi,均质9次,即得到平均粒径为192.3 nm,PDI为0.113,包封率为68.9%的载药纳米粒子。2.DSC图谱显示,合成的FA-F127相变温度消失;1H-NMR图谱显示,氢谱峰显示出FA-F127独特的氢谱峰,无其他杂质峰,以上均证明FA与F127是通过化学结合的方式连接,而不是简单的物理混合物。3BP-LCNP-FA在PLM下同样显示为暗视野,表明FA-F127并不改变立方液晶的晶型结构;3BP-LCNP-FA的纳米粒子粒径为201.7 nm,PDI为0.102,具有与3BP-LCNP相似的粒径分布曲线,表明FA-F127对立方液晶的粒径无明显影响;TEM下观察3BP-LCNP-FA的粒子形态为光滑圆整、无黏连的类球形粒子;3BP-LCNP-FA的包封率达到70.23%,RSD小于4%。3.3BP-LCNP-FA的体外累积释放显示,3BP在3 h内的累积释放量达到96.89%,而3BP-LCNP-FA仅为21.99%。24h到达79.62%,48h达到90.76%,表明3BP-LCNP-FA具有一定的缓释作用;在CNE2Z细胞中,不同药物剂型对细胞形态及密度变化相似,而在MDA-MB-231细胞中,3BP-LCNP-FA可以明显降低细胞密度,使细胞形态改变,细胞核分裂、变大;通过MTT结果显示,空白载体对CNE2Z和MDA-MB-231细胞无明显的增殖抑制作用,细胞存活率均大于90%,具有较好的细胞相容性。在CNE2Z中,3BP浓度为50mmol/L时,3BP的和3BP-LCNP的抑制率为4.87%和7.83%。而3BP-LCNP-FA的抑制率达到86.3%,随着3BP浓度的增加3BP、3BP-LCNP、3BP-LCNP-FA在125mmol/L时具有相似的作用效果,但是在MDA-MB-231细胞中,随着3BP浓度的增加,在125mmol/L时,3BP和3BP-LCNP对细胞的抑制率为10.23%和32.4%,而3BP-LCNP-FA的抑制率达到73.37%。ATP水平检测结果表明,3BP、3BP-LCNP、3BP-LCNP-FA显著降低CNE2Z细胞内的ATP水平,但在MDA-,B-231细胞中。3BP对降低细胞内水平不显著,3BP-LCNP、3BP-LCNP-FA均可以显著降低细胞内ATP水平。4.3BP-LCNP-FA体内药效学实验表明,在给药期间,3BP-LCNP-FA组荷瘤裸鼠肿瘤体积变化趋势明显变小,最终瘤体积和瘤重与3BP组相比有显著性差异,肿瘤抑制作用较3BP优异。3BP在给药期间裸鼠体重呈下降趋势,其他组未见该趋势;不同给药组AST、ALT、Cr、BUN水平均在正常范围内变化;H&E染色未观察到肝肾组织损伤形态。PCNA免疫组化结果可见3BP-LCNP-FA给药组阳性颗粒褐色颗粒较少,肿瘤细胞的增殖活性较弱;Tunel染色结果显示,3BP-LCNP-FA的阳性颗粒绿色荧光表明,3BP-LCNP-FA给药组肿瘤细胞凋亡活性较强。3BP-LCNP-FA对肿瘤组织较3BP具有更强的抑制作用。结论:综上所述,制备的3BP-LCNP-FA处方合理、制备工艺可行,制备成的纳米粒子粒径符合要求,大小均一、无黏连,并且具有一定的缓释作用。3BP-LCNP-FA作用于CNE2Z、MDA-MB-231具有较3BP更好的抑制作用,且呈MCT1依赖性。3BP-LCNP-FA在荷瘤裸鼠体内具有较好的治疗作用,且无明显的毒副作用。以上结果表明叶酸修饰的3-溴丙酮酸脂质立方液晶可以作为新型递药体系,具有潜在的临床研究意义。