研究背景:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以T、B细胞活化、大量不同的自身抗体、免疫复合物(IC)形成和多组织器官受损为主要特征的全身性自身免疫性疾病,以育龄期青年女性多见。其病因及发病机制尚不明确,参与SLE发病的机制包括遗传因素、环境因素、激素水平和免疫调节等。SLE发病的免疫学机制几乎覆盖了整个免疫系统网络,其中固有免疫系统和适应性免疫系统扮演着非常重要的角色。固有免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)从而发挥清除外来病原体和激活适应性免疫应答的作用,被认为是人体的第一道免疫屏障系统。在目前发现的PRRs中,部分NOD样受体(nucleotide binding oligome-rization domain-like receptors,NLRs)可被激活,形成一种胞内高分子量蛋白复合体即“炎性小体”。后者将半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteinase,Caspase-1)激活,并促进促炎细胞因子白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)和白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)的形成和活化,并以活性形式发挥调节机体炎症反应和免疫应答的作用。已报道的炎性小体主要有:IPAF(ice-protease-activating factor)和AIM2(absent in melanoma 2)、Nod样受体蛋白1(Nod-like receptor protein1,NLRP1)、Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein3,NLRP3),其中NLRP3炎性小体研究最为广泛。在我们的前期研究中发现,与健康人相比,NLRP3炎性体组分(NLRP3、Caspase-1、ASC)和IL-1β的mRNA及蛋白表达在SLE患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中显著降低,并与病情活动相关指标(抗ds-DNA抗体、SLEDAI评分、抗AnuA抗体等)等负相关,表明NLRP3炎性体的失活参与SLE发病,推测NLRP3可能是SLE的保护性因子,但其如何发挥作用,尚未完全阐明。干扰素(interferon,IFN)是一种重要的化学本质为蛋白质的细胞因子,在体内主要发挥抗病毒感染、抗细胞增殖、有效调控细胞分裂、调节免疫活化等作用。其与细胞膜表面的相应受体IFNAR结合,进而激活一种非受体型酪氨酸蛋白激酶(Janus Kinase,JAK),并引起受体分子的二聚化。激酶JAK催化结合在受体上的信号转录因子转导和转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STAT)蛋白发生磷酸化修饰使其活化,磷酸化的STAT二聚化并转移至细胞核内与靶基因结合,从而调控基因的转录。JAK-STAT信号通路功能广泛,在免疫反应与免疫调控中发挥重要作用。近年来多项研究表明,SLE患者血清存在I型和III型干扰素的高表达,并且与SLE病情活动及严重程度密切相关。因此,我们推测,SLE患者存在干扰素负向调控NLRP3炎性体的机制,但具体机制尚未阐明。目的:本研究通过检测干扰素等因子在SLE患者的表达探讨干扰素负向调控NLRP3炎性小体信号通路在SLE发病中的作用及临床意义。方法:本研究分别纳入山东大学附属省立医院风湿免疫科2018年12月至2019年12月期间住院治疗的SLE患者42例(SLE组)及同期该院查体中心的健康人30例(健康对照组)。两组研究对象PBMC中IFN-α、IFN-β、IFNλ1、NLRP3炎性小体组分(ASC、NLRP3、Caspase-1)及其下游因子IL-18、IL-1β的mRNA表达量用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法检测,Human Magnetic Luminex Assay法检测血清IFN-α、IFN-β、IL-18、IL-1β的表达水平,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay,ELISA)检测血清IFNλ1的表达水平。分析上述指标表达量及其与临床表现、实验室指标、病情活动评价等资料的相关性。结果:1.RT-PCR实验结果显示:与健康对照组相比,SLE组PBMC中IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、NLRP3、IL-1β mRNA呈低表达(P<0.0001;P<0.0001;P<0.0001;P=0.006;P=0.0007);ASC、IL-18的mRNA表达量呈高表达,但差异无统计学意义(P=0.2728;P=0.8078),Caspase-1的mRNA表达量在SLE组与健康对照组中无明显统计学差异(P=0.1741)。2.ELISA及Luminex实验结果显示:SLE组血清IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、IL-18和IL-1β表达均显著高于健康对照组(P=0.0003;P=0.0371;P=0.0126;P<0.0001;P=0.0089)。3.与SLE经治组相比,SLE初诊组PBMC中IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、ASC、Caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β mRNA表达量均无明显差异(P=0.077、0.276、0.59、0.98、0.159、0.179、0.348、0.307)。4.与SLE初诊组相比,SLE经治组血清IFN-β呈低表达(P=0.018),IFN-α、IFN-X1、IL-18和IL-1β在两组间表达无明显差异(P=0.125;P=0.276;P=0.06;P=0.291)。5.与SLE无肾损害组相比,LN组IPBMC中IFN-α IFN-β、IFN-λ1、NLRP3炎性小体组分及下游因子mRNA表达量无明显差异(0.4869±0.6729 vs 0.6555±0.8109(P=0.22)、0.7963±0.6131 vs 0.8543±0.3290(P=0.04)、0.6673±0.7690 vs 0.4704±0.3450(P=0.953)、0.3914±0.1553 vs 0.4619±0.2427(P=0.555)、0.8063±0.3089 vs 0.8162±0.4344(P=0.734)、0.4679±0.6313 vs 0.2952±0.1729(P=0.768)、0.7942±0.7023 vs 0.6867±0.3172(P=0.913)、0.5349±1.1838 vs 0.2251 ±0.3171(P=0.639))。6.与SLE无肾损害组相比,LN组血清IFN-α、IFN-β表达量较高:2.3692+1.8534 vs 8.5890±6.1574(P=0.006)、7.4972±15.6107 vs 88.6778±157.9863(P=0.006);IL-18、IL-1 β的表达量较高,但差异无统计学意义(557.6416±234.5273 vs 659.7910±499.0469(P=0.745)、3.6400±0.6842 vs44.5550±97.8658(P=0.147));LN组血清IFN-λ1的表达量较低:145.9535±46.6974 vs 125.2203±28.5743,但差异无统计学意义(P=0.14)。7.SLE不同疾病活动度组患者PMBC中IFN-α、IFN-β、IFNλ1、NLRP3炎性小体各组分及其下游细胞因子mRNA表达量结果显示,仅Caspase-1在轻度活动组较重度活动组高表达(0.9359±0.3899 vs 0.6196±0.1350,P=0.027),而IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、ASC、NLRP3、IL-18、IL-1β在SLE不同疾病活动度组间均无明显差异。8.在SLE不同疾病活动度组患者血清中,IFN-α、IFN-β在重度活动组呈高表达(1.6775±0.4757 vs 9.0738±6.1409(P=0.05)、2.0365±0.6734 vs 9.0738±6.1409(P=0.009)、3.6708±3.8431 vs 9.0738±6.1409(P=0.044);2.4875±0.5950 vs 100.8529±178.6054(P=0.01)、10.5641±21.1690 vs 100.8529±178.6054(P=0.014)、10.9615±23.3644 vs 100.8529±178.6054(P=0.024)),IFN-λ1、IL-18、IL-1β在不同疾病活动度组表达无明显差异。9.相关分析结果显示:SLE组PBMC中IFN-α mRNA表达量和IFN-β表达量存在正相关(r=0.43 71,P=0.0016);与IFN-λ1、ASC、Caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1βmRNA表达量无相关性(r=0.2280、0.0065、0.0751、0.0647、0.0580、-0.2138,P=0.1464、0.9675、0.6366、0.6841、0.7223、0.1853)。IFN-β mRNA表达量与IFN-λ1、ASC、Caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β mRNA表达量均无相关性(r=0.2288、-0.1390、0.0620、0.2813、-0.0175、-0.0854,P=0.1450、0.3801、0.6967、0.0711、0.9144、0.6004)。IFN-λ1 mRNA表达量与ASC、Caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β mRNA表达量无相关性(r=0.1739、0.2123、0.0006、-0.2066、-0.1423,P=0.2707、0.1770、0.9972、0.2010、0.3810)。NLRP3 mRNA表达量与IL-1β mRNA表达量成正比(r=0.4749,P=0.002),与ASC、Caspase-I、IL-18 mRNA表达量无相关性(r=-0.0295、0.1734、-0.1087,P=0.8529、0.2720、0.5042)。ASC mRNA表达量与Caspase-1 mRNA表达量呈正相关(r=0.6904,P<0.0001),与IL-18、IL-1β mRNA表达量无相关性(r=0.1854、0.0273,P=0.2520、0.8672)。Caspase-1 mRNA表达量与IL-18、IL-1β均无明显相关性(r=-0.0028、0.1977,P=0.9865、0.2214);IL-18 mRNA表达量与IL-1β表达量无明显相关性(r=0.1177,P=0.4696)。10.SLE组 PBMC 中 IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、NLRP3 炎性小体各组分及IL-18、IL-1βmRNA表达量与SLE病情活动评价指标(SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、血沉(ESR)及C反应蛋白(CRP))之间的相关分析10.1 SLE组PBMC中IFN-α mRNA表达量与ESR、CRP表达量呈负相关(r=-0.3256、-0.3675,P=0.0354、0.0167),与SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体表达量无相关性(r=0.0238、-0.1778、0.1052,P=0.8812、0.2600、0.5075)。10.2 SLE组PBMC中IFN-β mRNA表达量与ESR、CRP表达量呈负相关(r=-0.4128、-0.3332,P=0.0066、0.0311),与SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体表达量无相关性(r=0.0545、-0.0010、0.1144,P=0.7316、0.9930、0.4706)。10.3 SLE组PBMC中IFN-λ1 mRNA表达量与CRP表达量呈负相关(r=-0.3486,P=0.0237),与SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、ESR表达量无相关性(r=-0.0952、-0.0869、-0.0404、-0.1653,P=0.5489、0.5842、0.7997、0.2955)。10.4 SLE组PBMC中NLRP3 mRNA表达量与SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、ESR 和 CRP 表达量无相关性(r=-0.0228、0.0034、0.0803、-0.2083、-0.1408,P=0.8859、0.9829、0.6131、0.1857、0.3740)。10.5 SLE组PBMC中ASC mRNA表达量与SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、ESR和CRP表达量无相关性(r=-0.1331、-0.1377、-0.2149、-0.0587、-0.2194,P=0.4008、0.3905、0.1717、0.7120、0.1626)。10.6 SLE组PBMC中Caspase-1 mRNA表达量与 SLEDAI评分负相关(r=-0.3566,P=0.0205),与抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、ESR和CRP表达量无相关性(r=-0.2707、-0.2687、-0.0701、-0.1494,P=0.0830、0.0853、0.6594、0.3451)。10.7 SLE组PBMC中IL-18 mRNA表达量与SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、ESR 和 CRP 表达量无相关性(r=0.1039、-0.1843、-0.1082、-0.0235、-0.0121,P=0.5234、0.2550、0.5062、0.8857、0.9409)。10.8 SLE组PBMC中IL-1βmRNA表达量与SLEDAI评分、抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、ESR和CRP表达量无相关性(r=-0.0613、-0.1093、-0.0330、-0.0931、-0.1371,P=0.7069、0.5020、0.8398、0.5677、0.3987)。11.相关分析结果表明,SLE组血清IFN-α表达量与IFN-β、IL-18、IL-1β表达量呈正相关(r=0.5820、0.3346、0.7511,P<0.0001、P=0.0303、0.0197),与IFN-λ1表达量无相关性(r=-0.0261,P=0.8694)。IFN-β表达量与IL-1β表达量呈正相关(r=0.9489,P<0.0001),与IFN-λ1、IL-18表达量无相关性(r=-0.0762、0.2887,P=0.6360、0.0672)。IFN-λ1 表达量与IL-18、IL-1β表达量无相关性(r=0.1539、-0.2979,P=0.3306、0.4362)。IL-18表达量与IL-1β表达量无相关性(r=-0.3660,P=0.3326)。12.相关分析结果表明,SLE组血清IFN-α表达量与抗AnuA抗体、SLEDAI、抗SM抗体、抗rRNP抗体呈正相关(r=0.3160、0.5303、0.4850、0.4033;P=0.0415、0.0003、0.0011、0.0081),与C3、C4呈负相关(r=-0.5045、-0.5491,P=0.0007、0.0002)。血清IFN-β表达量与抗AnuA抗体、SLEDAI、24小时尿蛋白定量、抗rRNP抗体呈正相关(r=0.3297、0.5589、0.3887、0.3620;P=0.0353、0.0001、0.012、0.02),与C3、C4呈负相关(r=-0.4526、-0.4724,P=0.003、0.0018)。血清IFN-λ1表达量与C3、CRP呈正相关(r=0.3237、0.3391;P=0.0365、0.028)。血清IL-18与IgE呈正相关(r=0.3067,P=0.0482);血清IL-1β与SLEDAI、IgM呈正相关(r=0.7095、0.8463,P=0.0323、0.004),与C4呈负相关(r=-0.8652,P=0.0026)。结论:1.Ⅰ型和Ⅲ型IFN在SLE患者转录和翻译水平的表达存在差异,与SLE的免疫反应密切相关并与SLE疾病活动相关,I型IFN参与LN的发病。2.在SLE患者PBMC中IFN、NLRP3炎性小体均呈低表达,IFN对NLRP3炎性小体可能呈负性激活作用,但IFN在SLE的发病过程中并非单独依赖NLRP3炎性小体信号通路的调控。3.SLE患者PBMC中Caspase-1 的表达与ASC呈正相关,与IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、NLRP3无明显相关性,推测其在SLE患者PBMC中的表达除受NLRP3炎性小体信号通路的调控作用外,可能存在其他调控Caspase-1表达的信号通路。4.SLE患者PBMC中NLRP3的表达与IL-1β正相关,血清IFN-α的表达与IL-18、IL-1β的表达呈正相关,IFN-β的表达与IL-1β呈正相关;IL-18和IL-1β的成熟与活化的介导可能不仅仅与NLRP3炎性小体信号通路的调控相关相关,与I型干扰素也密切相关。