由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)引起的华支睾吸虫病是一种危害人体健康的食源性寄生虫病。当慢性反复感染后,华支睾吸虫虫体在肝胆管内可造成机械性阻塞,虫体的机械性刺激以及虫体的分泌代谢产物可引起继发性细菌感染和毒性效应等免疫病理反应,临床上可诱发很多肝胆管疾病,如胆道梗阻、胆管炎、结石形成、肝胆脓肿和肝纤维化等,最终可导致肝癌和胆管癌。尽管在20世纪期间华支睾虫病与肝/胆管癌之间的病因学关系已获普遍公认,华支睾吸虫诱发肝/胆管癌发生发展的具体分子机制仍不清楚。目前的研究表明华支睾吸虫致肝/胆管癌主要与虫体对胆管造成的机械性损伤作用、虫体的自身排泄/分泌代谢产物(ESP)作用、炎症反应和基因改变等过程密切相关。本实验室前期研究发现华支睾吸虫Severin蛋白(Csseverin)属于华支睾吸虫ESP成分之一,经体外实验表明Csseverin能抑制肝癌细胞PLC的凋亡,为研究华支睾吸虫致肝/胆管癌的作用机制提供了新的线索,因此我们需要在前期研究的基础上有必要进一步探讨Csseverin蛋白在华支睾吸虫诱发肝/胆管癌发生发展过程中的作用。在本研究中,我们构建了细胞内稳定表达Csseverin蛋白的慢病毒肝癌细胞株,对一系列凋亡因子的检测后发现Csseverin可以抑制线粒体通透性转换孔道(MPTP孔)开放、细胞色素c(Cyt c)释放等线粒体凋亡途径,且此途径受csseverin的钙离子结合功能调控;另一方面我们利用原核表达获得纯化蛋白rcsseverin,用不同浓度的rcsseverin蛋白体外孵育胆管癌细胞系,体外实验发现rcsseverin蛋白可以调控细胞侵袭性伪足的形成,进一步促进胆管癌细胞的迁移以及侵袭能力。探讨华支睾吸虫esp成分之一csseverin在肝胆管癌细胞凋亡、迁移和侵袭过程中的作用,可以进一步为华支睾吸虫的致病机制研究奠定基础。研究目的探讨csseverin在华支睾吸虫诱发肝/胆管癌发生发展过程中的作用。研究方法和结果1.采用慢病毒表达载体,构建csseverin过表达的肝癌细胞pez-lv203-csseverinplc和空载对照的肝癌细胞pez-lv203plc将目的质粒pez-lv203-csseverin及空载质粒pez-lv203同慢病毒包装质粒与endofectintmlenti转染试剂共转染入293t细胞,在37℃,5%co2细胞培养箱里培养约48小时后,获得慢病毒浓缩液。将慢病毒浓缩液感染对数期生长中的肝癌细胞plc,共孵育72小时后换用含3μg/ml嘌呤霉素的培养基进行1-2周筛选。挑选单克隆扩增后观察细胞内gfp绿色荧光。2.验证细胞内csseverin基因的过表达情况westernblotting检测pez-lv203-csseverinplc和pez-lv203plc中的csseverin表达,对转染细胞系进行csseverin表达水平的验证。3.pez-lv203-csseverinplc、pez-lv203plc和plc细胞在一定诱导条件后:检测凋亡相关指标以csseverin过表达的肝癌细胞pez-lv203-csseverinplc为实验组,空载对照的肝癌细胞pez-lv203plc和肝癌细胞plc为对照组,进行annexinⅤ-pe/7-aad双染后检测细胞的凋亡百分比;采用westernblotting检测凋亡相关因子caspase3和caspase9的激活情况;分别提取线粒体和胞浆蛋白,通过westernblotting分别检测线粒体上和胞浆中bax、cytc的含量。4.pez-lv203-csseverinplc、pez-lv203plc和plc细胞在一定诱导条件后:检测细胞内游离的钙离子浓度以csseverin过表达的肝癌细胞pez-lv203-csseverinplc为实验组,空载对照的肝癌细胞pez-lv203plc和肝癌细胞plc为对照组,进行钙离子荧光探针rhod-2/am标记后,通过激光共聚焦显微镜对细胞内游离钙离子浓度的变化进行观察。5.pez-lv203-csseverinplc、pez-lv203plc和plc细胞在一定诱导条件后:检测细胞内线粒体通透性转换孔道(mptp)的开放程度以csseverin过表达的肝癌细胞pez-lv203-csseverinplc为实验组,空载对照的肝癌细胞pez-lv203plc和肝癌细胞plc为对照组,进行tmrm标记后,分别通过荧光显微镜和流式细胞术检测细胞内mptp开放程度的变化。6.csseverin的原核表达和纯化保存的重组质粒csseverin-pet28a(+)经测序比对并验证后,转化入大肠杆菌bl21,利用iptg诱导重组大肠杆菌表达蛋白,收集含有rcsseverin的培养上清,通过12%sds-page检测目的蛋白条带,使用his亲和层析柱得到纯化的rcsseverin。7.rcsseverin对体外培养的胆管癌细胞的作用原核表达的重组蛋白(rcsseverin)经去内毒素试剂盒去除内毒素后,不同浓度(1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml)的rcsseverin蛋白分别与胆管癌细胞frh-0201和rbe孵育,pbs组为对照。通过细胞划痕实验和transwell迁移和侵袭实验,探讨rcsseverin对胆管癌细胞侵袭转移的影响。8.rcsseverin对胆管癌细胞侵袭性伪足形成的影响胆管癌细胞frh-0201和rbe铺入基质胶后,与最佳浓度的rcsseverin蛋白孵育,pbs组为对照。通过扫描电镜观察rcsseverin对细胞侵袭性伪足的形成的影响以及细胞对基质胶降解能力的影响;进行鬼笔环肽标记细胞骨架后,通过激光共聚焦显微镜观察rcsseverin对细胞侵袭性伪足的形成的影响。研究结果1.采用慢病毒表达载体,构建csseverin过表达的肝癌细胞pez-lv203-csseverinplc和空载对照的肝癌细胞pez-lv203plc挑选单克隆扩增后的plc细胞在荧光显微镜下观察到gfp绿色荧光,表明plc细胞被慢病毒浓缩液成功感染。2.验证细胞内csseverin基因的过表达情况westernblotting结果显示,与pez-lv203plc细胞相比,csseverin蛋白明显表达于pez-lv203-csseverinplc细胞中,表明成功构建了csseverin过表达稳定转染肝癌细胞株。3.pez-lv203-csseverinplc、pez-lv203plc和plc细胞在一定诱导条件后:检测凋亡相关指标以pez-lv203-csseverinplc细胞为实验组,pez-lv203plc细胞和plc细胞为对照组,将细胞经过饥饿诱导。流式细胞术检测结果显示,pez-lv203-csseverinplc、pez-lv203plc和plc细胞的凋亡率分别为9.85%、32.10%和34.51%,与对照组细胞(pez-lv203plc和plc)相比,实验组细胞(pez-lv203-csseverinplc)的凋亡率明显减少;westernblotting结果显示,与pez-lv203plc和plc细胞相比,csseverin的过表达组pez-lv203-severinplc细胞能明显抑制caspase3和caspase9的激活;分别提取线粒体和胞浆蛋白,westernblotting检测细胞线粒体和细胞浆中凋亡促进因子bax和cytc的含量,结果显示与pez-lv203plc和plc细胞相比,csseverin的高表达组pez-lv203-severinplc细胞能明显抑制bax从胞浆向线粒体内的转位,进一步抑制线粒体内cytc向胞浆内的释放。4.pez-lv203-csseverinplc、pez-lv203plc和plc细胞内游离的钙离子浓度检测以pez-lv203-csseverinplc细胞为实验组,pez-lv203plc细胞和plc细胞为对照组,将细胞经过饥饿诱导,加入钙离子荧光探针rhod-2/am,避光孵育。激光共聚焦显微镜下观察显示,与pez-lv203plc和plc细胞相比,csseverin的过表达组pez-lv203-severinplc细胞内红色荧光强度明显减弱,游离钙离子浓度降低。提示csseverin可以明显抑制plc细胞内游离钙离子浓度。5.pez-lv203-csseverinplc、pez-lv203plc和plc细胞内线粒体通透性转换孔道(mptp)的开放程度鉴定以pez-lv203-csseverinplc细胞为实验组,pez-lv203plc细胞和plc细胞为对照组,将细胞经过饥饿诱导,进行tmrm标记,避光孵育。流式细胞术和荧光显微镜结果显示,csseverin的过表达组pez-lv203-severinplc细胞线粒体内tmrm红色荧光强度较对照组细胞(pez-lv203plc和plc)有明显增强,线粒体内荧光增强,表明mptp的开放程度减弱。提示csseverin可以明显抑制plc细胞内mptp孔的开放。6.csseverin的原核表达和纯化重组质粒csseverin-pet28a(+)测序证实正确。经iptg诱导表达、his亲和层析柱得到纯化的rcsseverin。12%sds-page检测到分子量为43kda的目的蛋白条带。7.rcsseverin对体外培养的胆管癌细胞的作用不同浓度(1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml)的rcsseverin蛋白分别与胆管癌细胞frh-0201和rbe孵育,pbs组为对照。细胞划痕实验结果显示,在0小时各组细胞间的划痕距离基本相等,24小时和48小时后,与pbs对照组相比,随着rcsseverin蛋白浓度的增加,细胞划痕区逐渐变窄,细胞迁移率逐渐增加。此外,transwell迁移和侵袭实验结果显示,与pbs对照组相比,随着rcsseverin蛋白浓度的增加,其穿孔细胞数逐渐增多。提示rcsseverin可以明显促进胆管癌细胞的迁移和侵袭能力。8.rcsseverin对胆管癌细胞侵袭性伪足形成的影响胆管癌细胞frh-0201和rbe铺入基质胶后,与最佳浓度的rcsseverin蛋白孵育,pbs组为对照。扫描电镜观察显示,与pbs对照组相比,rcsseverin孵育组的胆管癌细胞其侵袭性伪足大量突起,基质胶降解明显。此外进行鬼笔环肽染色后通过激光共聚焦显微镜观察显示,与pbs对照组相比,rcsseverin孵育组的胆管癌细胞的侵袭性伪足明显聚集,向外延伸。提示rcsseverin可以促进胆管癌细胞侵袭性伪足的形成。研究结论1.csseverin过表达后可以通过调节肝癌细胞plc内游离钙离子浓度,抑制线粒体通透性转换孔道(mptp)的开放,下调bcl-2家族蛋白促凋亡因子bax的线粒体转位,随后抑制cytc释放至胞浆,控制caspase级联反应,发挥其抗凋亡作用。2.rcsseverin蛋白与肝门部胆管癌细胞frh-0201和肝内胆管癌细胞rbe共孵育后,可通过诱导细胞侵袭性伪足的形成来促进胆管癌细胞的迁移和侵袭作用。上述结果显示,Csseverin可以通过对细胞凋亡、迁移和侵袭过程的调控,进一步促进华支睾吸虫病患者肝胆管癌的发生发展。