【摘 要】
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背景:肝卵圆细胞具有干细胞特性,在肝脏受到严重损伤时可以分化为肝细胞以及胆管上皮细胞,目前肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞的分子机制尚未完全阐明。目的:利用蛋白组学技术结合生物信息学方法分析小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞过程中显著差异表达蛋白的生物学功能、参与的信号通路以及蛋白质互作网络,并进一步筛选可能参与小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞的关键蛋白,为探索小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细
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背景:肝卵圆细胞具有干细胞特性,在肝脏受到严重损伤时可以分化为肝细胞以及胆管上皮细胞,目前肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞的分子机制尚未完全阐明。目的:利用蛋白组学技术结合生物信息学方法分析小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞过程中显著差异表达蛋白的生物学功能、参与的信号通路以及蛋白质互作网络,并进一步筛选可能参与小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞的关键蛋白,为探索小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞的分子机制提供新思路。方法:1、通过2-AAF/2/3PH构建小鼠肝卵圆细胞活化模型,利用二步酶消化法、Percoll密度梯度离心法提取肝卵圆细胞并于体外条件下联合利用表皮生长因子、干细胞生长因子、白血病抑制因子诱导其定向分化为胆管上皮细胞,根据细胞形态学表现及流式细胞学结果确定原代肝卵圆细胞完全分化为CK19?胆管上皮细胞所需传代次数。2、应用基于LC-MS/MS的label-free定量蛋白组学技术筛选小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞过程中显著差异表达蛋白质,并通过GO功能富集分析、KEGG通路富集分析以及STRING蛋白互作网络分析探索显著差异表达蛋白的主要功能、参与的信号通路以及蛋白互作网络,并进一步筛选可能参与该分化的关键蛋白。3、运用免疫荧光以及WB技术对可能参与肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞的关键蛋白进行验证。结果:1、由小鼠2-AAF/2/3PH模型分离出的相对纯化的肝卵圆细胞在表皮生长因子、干细胞生长因子、白血病抑制因子的作用下分化至第8代可获得较为纯化的CK19?胆管上皮细胞。2、利用蛋白组学技术结合生物信息学方法对小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞过程中显著差异表达蛋白质的分析显示这些蛋白不仅参与转录、翻译、能量合成与释放、物质代谢、免疫反应等必要生物学过程,还参与炎症、肿瘤以及多种肝脏疾病相关通路。根据蛋白所参与生物学过程的GO注释进一步筛选出与干细胞分化相关的且在原代细胞中表达量为0的显著差异表达蛋白Zfp281以及Cdk13。3、Zfp281以及Cdk13均在肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞的初始阶段主要表达于胞质,并随着分化的进展逐渐在胞核呈现高表达,并且在这一过程中表达量均发生显著上调,与先前蛋白质组学的结果基本一致。结论:Zfp281以及Cdk13表达量随细胞分化的进展而发生显著上调,并且空间表达位置由胞质进入胞核,提示这两个蛋白可能在肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞相关基因转录调控中发挥重要作用。
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