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分枝杆菌属（Mycobacterium）是一个庞大的家族，包含大量分布于世界各地的致病的和条件致病的分枝杆菌，主要包括结核分枝杆菌复合群（MTBC）、麻风分枝杆菌（M.leprae）和非结核分枝杆菌（NTM），能够引起广泛的传染性疾病。因此，正确和及时的分枝杆菌鉴定方法对其治疗和流行病学是非常重要的。 本研究基于前期对145种253株库存国际参照菌株在hsp65、rpoB和sodA等3个基因的扩增测序结果，找出了针对分枝杆菌hsp65基因的保守序列以及针对瘰疬分枝杆菌sodA基因、结核分枝杆菌复合群（MTBC）中的两大成员（结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌）rpoB基因的特异突变碱基，分别设计检测分枝杆菌以及瘰疬分枝杆菌、MTBC中的两大成员的荧光定量PCR引物和探针，并且，根据鸟分枝杆菌在IS1245基因上的特异序列以及之前工作发现的牛分枝杆菌pstS1基因的特异碱基突变，分别设计检测鸟及牛分枝杆菌的荧光定量PCR引物和探针，从而建立快速检测分枝杆菌、特异性检测瘰疬分枝杆菌、MTBC中的两大成员（结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌）、鸟分枝杆菌及牛分枝杆菌等5种TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。以21株分枝杆菌标准株、89株分枝杆菌临床株、7种其它呼吸道致病菌的DNA为模板，验证这5种方法的特异性及符合度；以含有相应靶基因的5组梯度拷贝数重组质粒DNA（107-100 copies/μL）为模板，分别检测5种方法的最低DNA检测下限，另外分别选取梯度浓度（106-100cells/μL）分枝杆菌标准株H37Rv、瘰疬分枝杆菌标准株95017、非洲分枝杆菌标准株95049、鸟分枝杆菌标准株95001、牛分枝杆菌标准株95055菌液作为模拟样本，检测5种方法对模拟样本的最低检测下限，联合评价方法的灵敏度；不同时间多次重复试验评估5种方法的稳定性。 结果显示，与DNA测序方法比较，这5种方法具有良好的特异性和符合度。基于hsp65基因的荧光定量PCR方法可将本研究中的分枝杆菌（110/110）快速检测出来，而检测其它细菌为阴性（7/7）；基于rpoB基因的荧光定量PCR方法可将MTBC中的两大成员（结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌）（28/28）检测出来，而检测其它细菌为阴性（89/89）；针对瘰疬、鸟、牛分枝杆菌的荧光定量PCR方法可分别特异性检测相应分枝杆菌（分别为1/1、35/35、17/17），而其它细菌的检测结果均为阴性（分别为116/116、82/82、100/100）；灵敏度较高，5种荧光定量PCR方法对于重组质粒DNA的最低检测下限均为101copies/μL，模拟样本最低检测下限除了基于sodA基因的荧光定量PCR方法为101cells/μL，其余均为均为102 cells/μL，标准曲线相关系数范围为0.972-0.997，显示良好的线性关系；稳定性好，5种荧光定量PCR方法显示Ct值变异系数小，批内实验变异系数小于5.67％，批间实验变异系数小于9.3%。 我们对收集到的包括牛奶、脊柱结核患者的脓液及干酪物、痰等类型的标本进行分离培养，获得15株分枝杆菌，包括从牛奶标本中分离到的2株NTM（象分枝杆菌及抗热分枝杆菌）、脊柱结核患者的脓液及干酪物中分离到的11株MTB以及痰标本中分离到的2株MTB。用本研究建立起来的5种荧光定量PCR方法验证这15株临床分离株，结果显示基于hsp65基因的荧光定量PCR方法可将这15株分枝杆菌快速检测出来，基于rpoB基因的荧光定量PCR方法可将这13株MTB快速检测出来，而其它3种方法，结果全为阴性，再次验证了5种方法的有效性及特异性。 对于分离到的分枝杆菌进行药敏试验分析。按照Alamar blue试验方法使用包括异烟肼，利福平，氧氟沙星等在内的27种药对2株NTM进行药敏分析，结果显示，2株NTM对27种抗生素中的阿米卡星，莫西沙星等8种抗生素敏感，而对一线抗结核药如利福平、异烟肼等均耐药。采用固体比例法检测13株MTB对8种一线和二线抗结核药的敏感性，全敏感菌株占38.5%，单耐药菌株占46.1%，双重或多重耐药菌株占15.4%，其中检测到的1株多重耐药菌解释了该患者相应药物治疗效果欠佳的原因，对于从痰标本中分离到的2株MTB行药敏试验，显示为全敏感株，为患者临床用药提供了参考。 总之，本研究基于hsp65、sodA、rpoB、IS1245或pstS1等基因建立的荧光定量PCR方法可快速检测分枝杆菌、特异性检测瘰疬分枝杆菌、MTBC中的两大成员（结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌）、鸟分枝杆菌或牛分枝杆菌，拥有快速、准确、有效的优点，对于分枝杆菌的生态和流行病学监测将具有重要意 义。本研究对收集到的包括牛奶、脊柱结核患者的脓液及干酪物、痰等类型的标本进行分离培养，最终获得15株分枝杆菌（2株NTM，13株MTB），并且是在国内首次从牛奶中分离培养到象分枝杆菌和抗热分枝杆菌。且用这15株菌来验证建立起来的5种荧光定量PCR方法，进一步证明了方法的有效性及特异性。