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第一部分阿尔茨海默病与肠道菌群相关性研究：以中美两国人群为例
【目的】
本部分探讨中美两国人群阿尔茨海默病(Alzhiemer’s disease, AD)肠道菌群的组成结构特点，旨在了解肠道菌群与AD的相关性，以及明显改变的肠菌种属，为进一步探讨肠道菌群影响AD进展提供理论支持。
【方法】
纳入从2017年07月至2020年02月在重庆第一人民医院等诊断为AD患者43名(China-AD组)和年龄、性别相匹配的非AD受试者43名(China-HL组)。所有受试者在入院48小时内完成粪便样本采集工作，完善头部核磁共振或CT等辅助检查，使用简易智力状态量表(MMSE)等评估认知功能。所有新鲜采集的粪便样本保存至已消毒的大便杯子中，并于1h内冻存于-80℃冰箱，用于后续粪便样本DNA提取、16SrRNA高通量测序技术分析其肠道菌群的组成结构特点，并与美国人群相比较。其中，美国籍AD患者从威斯康星州阿尔茨海默病研究中心进行招募(USA-AD组，n=25)，美国籍非AD参与者(USA-HL组，n=25)从该中心和威斯康星州预防阿尔海默病注册机构中招募。
【结果】
1.China-AD组与China-HL组相比，APOEε4携带者频率较高(P＜0.05)，MMSE评分较低(P＜0.05)。中国人群在性别、年龄、高血压、糖尿病、高胆固醇血症、冠心病、教育及并发症中未见显著性差异(P＞0.05)。美国人群在年龄、性别、种族、BMI及糖尿病状态方面亦未见显著性差异(P＞0.05)。APOEε4基因型在AD组中更为普遍(P＜0.05)。大多数USA-AD组的参与者患有轻度或中度认知功能障碍，临床痴呆评分(CDR)评分范围为0.5-2。
2.Alpha多样性指数分析示：USA-HL组与USA-AD组、China-AD组及China-HL组相比，Sobs指数值升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；而China-AD组与China-HL组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.厚壁菌门和拟杆菌门是各组中占绝对优势的菌门。USA-AD组的拟杆菌门的丰度比China-AD组(17.64% vs 8.0%)、China-HL组(17.64% vs 12.56%)及USA-HL组升高(17.64% vs 14.58)；China-AD组的变形杆菌门较USA-AD组升高(13.26% vs 0.81%)；China-HL组变形杆菌门丰度较USA-HL组升高(12.57%vs 1.98%)。在属的水平上，USA-AD组的布劳特氏菌属的丰度比其余三组升高(15.79% vs 7.08%, 7.47%, 9.76)；China-AD组的粪肠杆菌门较China-HL组升高(9.82% vs 7.42%)；China-HL组变形杆菌门丰度较China-AD组升高(11.13% vs 4.19%)。
4.LEfSe分析可见China-AD组与China-HL组的肠道菌群结构具有明显的不同。China-AD组中多种有益菌群,如乳酸杆菌属、解琥珀酸菌属减少(P＜0.05)，而香孢菌属及厌氧菌属等有害菌属出现明显增加(P＜0.05)；而USA-AD组则出现了瘤胃球菌属等有益菌群明显减少(P＜0.05)，而拟杆菌属增加(P＜0.05)。
5.AD组中多种条件致病菌，如克氏菌属、不动杆菌属、放线杆菌属及假单胞菌属等出现了増加的现象,而瘤胃球菌属等菌群明显减少(P＜0.05)。
6.利用随机森林法进行机器学习分析，结果提示可根据肠道菌群组成结构来预测中美两国人群AD与健康人群，但具有较低的敏感性和特异性(AUC值为0.66)。
【结论】
中美两国人群中的AD患者与对照组相比，出现较明显的肠道菌群组成性差异。中国人群AD患者肠道菌群中多种有益菌如乳酸杆菌属、解琥珀酸菌属减少，而香孢菌属及厌氧菌菌纲出现明显增加的现象。美国人群AD患者中则出现了瘤胃球菌属等有益菌群明显减少，而拟杆菌属等有害菌群增加的特点。
第二部分阿尔茨海默病肠道菌群外膜囊泡提取及代谢组学分析
【目的】
本部分探讨AD患者肠道菌群外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)代谢组学特征，筛选潜在的生物代谢标志物并评价其诊断价值，从而为进一步探讨肠道菌群代谢物OMVs影响AD进展提供理论支持。
【方法】
招募9名AD患者以及年龄和性别相匹配的9名对照受试者，并收集粪便。经超高速离心等技术提取，经电镜、纳米粒子跟踪分析等技术鉴定，获得纯化的肠道菌群OMVs，然后使用液相色谱-串联质谱方法结合一系列多元统计分析软件进行生物信息学分析。
【结果】
1.AD-OMVs与HL-OMVs相比，代谢物种类及含量存在显著差异。在AD-OMVs中，天冬氨酸，L-天冬氨酸，4-唑咪和L-谷氨酸的水平被证实高度上调。经AD-OMVs代谢组学分析也筛选出其它差异代谢物，如花生酸四烯酸、前列腺素G2和白三烯B4。
2.通过测量归一化后的峰面积来量化代谢物的丰度。与HL-OMVs相比，AD-OMVs中有90种不同丰度的肠道菌群差异代谢物，其中在AD-OMVs代谢物中天冬氨酸、L-谷氨酸、吲哚-3-乙酸、L-天冬氨酸、4-甲基伞形酮、咪唑-4-乙酸酯、前列腺素G2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)丰度显着增加。而AD-OMVs中4-半醛、富马酸、aerobactin、黄嘌呤、N2-琥珀酰-L-谷氨酸5-半醛、十三烷酸、L-吡喃葡萄糖和胆碱的丰度显着降低。
3.AD-OMVs差异代谢物表现出良好的ROC曲线和较高的AUC值。七种代谢物，包括4-半醛(AUC=0.951)、PGE2(AUG=0.938)、20-羟基-二十碳四烯酸(AUG=0.938)、aerobactin(AUG=0.938)、L-吡喃葡萄糖(AUG=0.926)，吲哚-3-乙酸(AUG=0.914)和4-甲基伞形酮(AUG=0.901)具有位居前7位的AUC值(均超过0.90)，表明出高度的灵敏度。咪唑-4-乙酸酯(AUG=0.889)，L-天冬氨酸(AUG=0.877)、富马酸(AUG=0.864)、十三烷酸(AUG=0.0.852)和胆碱(AUG=0.0.815)具有相对高的AUC值。
4.AD-OMVs的代谢物定位到代谢网络中，发现重要的生化代谢途径和信号转导途径，包括组氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、胆碱能突触代谢、色氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。
5.在花生四烯酸代谢途径中，PGE2和白三烯B4水平在AD-OMVs中显着上调。与健康对照组相比，AD组胆碱水平显着降低，吲哚-3-乙酸、富马酸、aerobactin、黄嘌呤、N2-琥珀酰-L-谷氨酸5-半醛、十三烷酸及L-吡喃葡萄糖具有较高的VIP或AUC值。
【结论】
本部分分析AD及健康人群肠道菌群OMVs代谢产物的差异。LC-MS/MS分析表明，在AD患者肠道菌群OMVs中发生代谢物改变。肠道菌群OMVs中的差异代谢物(例如4半醛、PGE2、20-羟基二十碳四烯酸、aerobactin，L-呋喃葡萄糖，吲哚-3-乙酸和4甲基伞形酮)具有较高的VIP值或AUC值，这对诊断AD具有重要意义。经过肠道菌群代谢途径和代谢物功能分析有助于AD病因的全面了解，这些差异代谢物可作为AD诊断的潜在生物学标志物。
第三部分阿尔茨海默病肠道菌群外膜囊泡对小鼠认知功能、肠道功能及Tau蛋白异常磷酸化的影响
【目的】
探讨肠道菌群OMVs对小鼠海马区组织形态、血脑屏障通透性、肠动力、学习记忆能力及Tau蛋白多个位点磷酸化的影响，为肠道菌群OMVs影响神经炎性反应、Tau蛋白磷酸化相关通路机制的研究提供理论支持。
【方法】
根据既往研究，在细胞水平上设置不同浓度梯度及时间梯度，以确定灌胃剂量及灌胃频率。将9月龄C57BL/6J小鼠依灌胃来源不同而分组：AD肠道菌群来源的OMVs处理小鼠组(AD-OMVs组)；健康对照受试者肠道菌群OMVs处理小鼠组(HL-OMVs组)和给予等体积PBS灌胃处理小鼠组(Control组)。连续灌胃8周后，用伊文思蓝实验评价不同来源的OMVs对血脑屏障的损害作用；Y迷宫、新物体识别、Morris水迷宫评估小鼠的学习、记忆等认知能力；印度墨汁染色实验检查小鼠肠动力；伊红-苏木紫染色观察各组大脑海马区炎症细胞浸润与分布情况；Westernblotting检测各组小鼠大脑海马区Tau蛋白不同磷酸化位点(p-TauT181、p-Tau396、p-Taup404)的磷酸化水平变化。
【结果】
1.经PKH26标记后的SH-SY5Y细胞，随着AD-OMVs剂量增加聚集量增多，平均荧光值有增加趋势；随着AD-OMVs作用时间延长聚集量增多，平均荧光值也有增加趋势，最终确定最佳灌胃浓度为50μM，每隔24h进行灌胃。
2.连续给予小鼠OMVs/PBS灌胃8周后，三组小鼠体重变化无明显差异(P＞0.05)，而洗脸、抓挠行为明显多于对照组(P＜0.05)，排粪便粒数低于对照组与HL-OMVs组(P＜0.05)，而三组小鼠的直立行为无明显差异(P＞0.05)。
3.Y迷宫用于评估即时空间工作记忆，相比于HL-OMVs及对照组，AD-OMVs组明显降低了小鼠的自发交替率(P＜0.05)、Y迷宫新臂停留时间(P＜0.05)及Y迷宫穿越新臂的次数(P＜0.05)。
4.新物体识别用于评估小鼠的学习探索能力，相较于HL-OMVs及对照组，AD-OMVs组小鼠对于新物体的偏好降低，表现在AD-OMVs组对新物体探索的时间比例较HL-OMVs组及对照组降低(P＜0.05)。
5.在Morris水迷宫的定位航行实验中，与HL-OMVs及对照组相比，AD-OMVs组小鼠的逃避潜伏期时间延长，在第五天的逃避潜伏期显著延长(P＜0.01)；HL-OMVs及对照组逃避潜伏期随时间延长而逐渐缩短，在第五天的逃避潜伏期均显著缩短(P＜0.01)。
6.印度墨汁染色实验未见三者有明显差异(P＞0.05)，尚不能说明肠道菌群OMVs对肠动力有影响。
7.伊文思兰实验结果示：与HL-OMVs及对照组相比，AD-OMVs血脑屏障通透性增加；Westernblotting显示AD-OMVs中Claudin-5表达量减少(P＜0.05)。
8.Westernblotting对引起Tau蛋白不同磷酸化位点检测显示：与HL-OMVs及对照组相比，p-Tau396、p-Tau404和p-TauT181的磷酸化水平有不同程度升高(P＜0.05)。
【结论】
经AD来源的肠道菌群OMVs灌胃后，C57BL/6J小鼠血脑屏障通透性增加，小鼠学习记忆功能受损，Tau蛋白磷酸化水平的增加促进AD病理性进程。
第四部分阿尔茨海默病肠道菌群外膜囊泡引起tau蛋白异常磷酸化机制的初步研究
【目的】
本部分探讨肠道菌群OMVs对神经炎症、Tau蛋白磷酸化的可能机制，并在细胞水平上，通过对SH-SY5Y细胞给予AD-OMVs处理及相关抑制剂干预，进一步证实动物水平上所观察到的Tau蛋白磷酸化及机制，最终为AD的治疗及新药的开发提供进一步的理论依据。
【方法】
结合Elisa法和Westernblotting检测经肠道菌群OMVs灌胃处理后小鼠海马区炎性因子谱(IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB)的表达；结合Westernblotting、免疫荧光及免疫组化技术检测小鼠海马区小胶质细胞、星形胶质细胞及结肠区肠胶质细胞活化；Westernblotting检测小鼠海马区GSK3β(GSK3-β、p-GSK3-β)及CDK5-Calpain通路蛋白(Calpain1、Calpain2、P25、P35、CDK5)的蛋白表达；结合Westernblotting、CKK8和流式细胞仪技术，检测SH-SY5Y细胞及加入CDK5抑制剂Roscovitine、GSK3β抑制剂AR-A014418，对细胞增殖、细胞凋亡、Tau蛋白磷酸化和CDK5或GSK3β蛋白表达的影响。
【结果】
1.免疫荧光定性观察经肠道菌群OMVs灌胃后三组小鼠结肠区GFAP分布及表达量无明显差异。WesternBlotting定量检测显示，与对照组相比，AD-OMVs组小鼠结肠区GFAP蛋白表达量无明显差异(P＞0.05)。同样，HL-OMVs组小鼠结肠区GFAP蛋白表达量较对照组相比，亦不具有统计学意义(P＞0.05)。尚不能说明肠道菌群OMVs对小鼠结肠肠神经胶质细胞有活化作用。
2.免疫荧光定性观察经肠道菌群OMVs灌胃后三组小鼠海马区GFAP分布及表达量无明显差异。WesternBlotting定量检测显示，与对照组相比，AD-OMVs组小鼠海马区GFAP蛋白表达量无明显差异(P＞0.05)。同样，HL-OMVs组小鼠海马区GFAP蛋白表达量较对照组相比，亦不具有统计学意义(P＞0.05)。尚不能说明肠道菌群OMVs对小鼠海马区星形胶质细胞有活化作用。
3.WesternBlotting定量检测，与对照组相比，AD-OMVs组小鼠海马区Iba1蛋白表达量增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。而HL-OMVs组小鼠海马区Iba1蛋白表达量较对照组相比，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。这说明肠道菌群AD-OMVs对小鼠海马区小胶质细胞有活化作用。
4.经WesternBlotting检测AD-OMVs组小鼠大脑海马区的NF-κB表达较对照组增加，经Elisa检测IL-6、IL-1β、TNF-α较对照组表达量均增加(P＜0.05)，而HL-OMVs组较对照组相比无明显差异(P＞0.05)。
5.CDK5-Calpain通路蛋白检测结果示，与对照组相比较，AD-OMVs组小鼠海马区P25、P35、CDK5、Calpain1及Calpain2蛋白表达量明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而HL-OMVs组较对照组相比，CDK5通路蛋白表达量差异不明显(P＞0.05)。
6.与对照组小鼠相比较，AD-OMVs组小鼠的p-GSK3β表达量减少，差异具有统计学差异(P＜0.05)；而HL-OMVs组与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。GSK3-β的表达量在三组小鼠中无差异且两两之间无统计学意义(P＞0.05)。
7.经AD-OMVs处理后的SH-SY5Y使用GSK3β阻滞剂AR-A01441810μM处理后表现出GSK3-β抑制作用，而细胞增殖、凋亡及Tau蛋白磷酸化水平未见明显变化趋势。
8.经流式细胞仪及CKK8试剂盒检测示：非抑制剂组(Control组、AD-OMVs组及HL-OMVs组)较抑制剂组(Rosc组、AD-OMVs+Rosc组及HL-OMVs+Rosc组)细胞凋亡及增殖未见明显增加(P＞0.05)。体外实验验证AD-OMVs可通过影响CDK5酶活性而促进Tau蛋白磷酸化：与对照组相比，AD-OMVs能增加SH-SY5Y细胞中CDK5的表达水平(P＜0.05)，同时p-TauT181、p-Tau396和p-Tau404的表达水平也上调；Roscovitine组CDK5、p-TauT181、p-Tau396和p-Tau404与Control组相比，表达水平降低(P＜0.05)；在给予抑制剂Roscvitine后，AD-OMVs组和HL-OMVs组之间Tau蛋白磷酸化水平的差异不明显(P＞0.05)。
【结论】
AD与肠道菌群关系复杂，单一的通路尚不能完全阐明其病理机制。AD来源的肠道菌群OMVs可致小胶质细胞活性增加及神经炎性因子(NF-κβ、IL-1β、IL-6、TNF-α)表达上调。AD来源的肠道菌群OMVs在Tau蛋白不同磷酸化位点均有升高(p-TauT181，p-Tau396及p-Tau404)，结合体内外实验，最终确定Tau蛋白磷酸化水平升高是主要是通过CDK5通路发挥作用的。
【目的】
本部分探讨中美两国人群阿尔茨海默病(Alzhiemer’s disease, AD)肠道菌群的组成结构特点，旨在了解肠道菌群与AD的相关性，以及明显改变的肠菌种属，为进一步探讨肠道菌群影响AD进展提供理论支持。
【方法】
纳入从2017年07月至2020年02月在重庆第一人民医院等诊断为AD患者43名(China-AD组)和年龄、性别相匹配的非AD受试者43名(China-HL组)。所有受试者在入院48小时内完成粪便样本采集工作，完善头部核磁共振或CT等辅助检查，使用简易智力状态量表(MMSE)等评估认知功能。所有新鲜采集的粪便样本保存至已消毒的大便杯子中，并于1h内冻存于-80℃冰箱，用于后续粪便样本DNA提取、16SrRNA高通量测序技术分析其肠道菌群的组成结构特点，并与美国人群相比较。其中，美国籍AD患者从威斯康星州阿尔茨海默病研究中心进行招募(USA-AD组，n=25)，美国籍非AD参与者(USA-HL组，n=25)从该中心和威斯康星州预防阿尔海默病注册机构中招募。
【结果】
1.China-AD组与China-HL组相比，APOEε4携带者频率较高(P＜0.05)，MMSE评分较低(P＜0.05)。中国人群在性别、年龄、高血压、糖尿病、高胆固醇血症、冠心病、教育及并发症中未见显著性差异(P＞0.05)。美国人群在年龄、性别、种族、BMI及糖尿病状态方面亦未见显著性差异(P＞0.05)。APOEε4基因型在AD组中更为普遍(P＜0.05)。大多数USA-AD组的参与者患有轻度或中度认知功能障碍，临床痴呆评分(CDR)评分范围为0.5-2。
2.Alpha多样性指数分析示：USA-HL组与USA-AD组、China-AD组及China-HL组相比，Sobs指数值升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；而China-AD组与China-HL组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.厚壁菌门和拟杆菌门是各组中占绝对优势的菌门。USA-AD组的拟杆菌门的丰度比China-AD组(17.64% vs 8.0%)、China-HL组(17.64% vs 12.56%)及USA-HL组升高(17.64% vs 14.58)；China-AD组的变形杆菌门较USA-AD组升高(13.26% vs 0.81%)；China-HL组变形杆菌门丰度较USA-HL组升高(12.57%vs 1.98%)。在属的水平上，USA-AD组的布劳特氏菌属的丰度比其余三组升高(15.79% vs 7.08%, 7.47%, 9.76)；China-AD组的粪肠杆菌门较China-HL组升高(9.82% vs 7.42%)；China-HL组变形杆菌门丰度较China-AD组升高(11.13% vs 4.19%)。
4.LEfSe分析可见China-AD组与China-HL组的肠道菌群结构具有明显的不同。China-AD组中多种有益菌群,如乳酸杆菌属、解琥珀酸菌属减少(P＜0.05)，而香孢菌属及厌氧菌属等有害菌属出现明显增加(P＜0.05)；而USA-AD组则出现了瘤胃球菌属等有益菌群明显减少(P＜0.05)，而拟杆菌属增加(P＜0.05)。
5.AD组中多种条件致病菌，如克氏菌属、不动杆菌属、放线杆菌属及假单胞菌属等出现了増加的现象,而瘤胃球菌属等菌群明显减少(P＜0.05)。
6.利用随机森林法进行机器学习分析，结果提示可根据肠道菌群组成结构来预测中美两国人群AD与健康人群，但具有较低的敏感性和特异性(AUC值为0.66)。
【结论】
中美两国人群中的AD患者与对照组相比，出现较明显的肠道菌群组成性差异。中国人群AD患者肠道菌群中多种有益菌如乳酸杆菌属、解琥珀酸菌属减少，而香孢菌属及厌氧菌菌纲出现明显增加的现象。美国人群AD患者中则出现了瘤胃球菌属等有益菌群明显减少，而拟杆菌属等有害菌群增加的特点。
第二部分阿尔茨海默病肠道菌群外膜囊泡提取及代谢组学分析
【目的】
本部分探讨AD患者肠道菌群外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)代谢组学特征，筛选潜在的生物代谢标志物并评价其诊断价值，从而为进一步探讨肠道菌群代谢物OMVs影响AD进展提供理论支持。
【方法】
招募9名AD患者以及年龄和性别相匹配的9名对照受试者，并收集粪便。经超高速离心等技术提取，经电镜、纳米粒子跟踪分析等技术鉴定，获得纯化的肠道菌群OMVs，然后使用液相色谱-串联质谱方法结合一系列多元统计分析软件进行生物信息学分析。
【结果】
1.AD-OMVs与HL-OMVs相比，代谢物种类及含量存在显著差异。在AD-OMVs中，天冬氨酸，L-天冬氨酸，4-唑咪和L-谷氨酸的水平被证实高度上调。经AD-OMVs代谢组学分析也筛选出其它差异代谢物，如花生酸四烯酸、前列腺素G2和白三烯B4。
2.通过测量归一化后的峰面积来量化代谢物的丰度。与HL-OMVs相比，AD-OMVs中有90种不同丰度的肠道菌群差异代谢物，其中在AD-OMVs代谢物中天冬氨酸、L-谷氨酸、吲哚-3-乙酸、L-天冬氨酸、4-甲基伞形酮、咪唑-4-乙酸酯、前列腺素G2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)丰度显着增加。而AD-OMVs中4-半醛、富马酸、aerobactin、黄嘌呤、N2-琥珀酰-L-谷氨酸5-半醛、十三烷酸、L-吡喃葡萄糖和胆碱的丰度显着降低。
3.AD-OMVs差异代谢物表现出良好的ROC曲线和较高的AUC值。七种代谢物，包括4-半醛(AUC=0.951)、PGE2(AUG=0.938)、20-羟基-二十碳四烯酸(AUG=0.938)、aerobactin(AUG=0.938)、L-吡喃葡萄糖(AUG=0.926)，吲哚-3-乙酸(AUG=0.914)和4-甲基伞形酮(AUG=0.901)具有位居前7位的AUC值(均超过0.90)，表明出高度的灵敏度。咪唑-4-乙酸酯(AUG=0.889)，L-天冬氨酸(AUG=0.877)、富马酸(AUG=0.864)、十三烷酸(AUG=0.0.852)和胆碱(AUG=0.0.815)具有相对高的AUC值。
4.AD-OMVs的代谢物定位到代谢网络中，发现重要的生化代谢途径和信号转导途径，包括组氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、胆碱能突触代谢、色氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。
5.在花生四烯酸代谢途径中，PGE2和白三烯B4水平在AD-OMVs中显着上调。与健康对照组相比，AD组胆碱水平显着降低，吲哚-3-乙酸、富马酸、aerobactin、黄嘌呤、N2-琥珀酰-L-谷氨酸5-半醛、十三烷酸及L-吡喃葡萄糖具有较高的VIP或AUC值。
【结论】
本部分分析AD及健康人群肠道菌群OMVs代谢产物的差异。LC-MS/MS分析表明，在AD患者肠道菌群OMVs中发生代谢物改变。肠道菌群OMVs中的差异代谢物(例如4半醛、PGE2、20-羟基二十碳四烯酸、aerobactin，L-呋喃葡萄糖，吲哚-3-乙酸和4甲基伞形酮)具有较高的VIP值或AUC值，这对诊断AD具有重要意义。经过肠道菌群代谢途径和代谢物功能分析有助于AD病因的全面了解，这些差异代谢物可作为AD诊断的潜在生物学标志物。
第三部分阿尔茨海默病肠道菌群外膜囊泡对小鼠认知功能、肠道功能及Tau蛋白异常磷酸化的影响
【目的】
探讨肠道菌群OMVs对小鼠海马区组织形态、血脑屏障通透性、肠动力、学习记忆能力及Tau蛋白多个位点磷酸化的影响，为肠道菌群OMVs影响神经炎性反应、Tau蛋白磷酸化相关通路机制的研究提供理论支持。
【方法】
根据既往研究，在细胞水平上设置不同浓度梯度及时间梯度，以确定灌胃剂量及灌胃频率。将9月龄C57BL/6J小鼠依灌胃来源不同而分组：AD肠道菌群来源的OMVs处理小鼠组(AD-OMVs组)；健康对照受试者肠道菌群OMVs处理小鼠组(HL-OMVs组)和给予等体积PBS灌胃处理小鼠组(Control组)。连续灌胃8周后，用伊文思蓝实验评价不同来源的OMVs对血脑屏障的损害作用；Y迷宫、新物体识别、Morris水迷宫评估小鼠的学习、记忆等认知能力；印度墨汁染色实验检查小鼠肠动力；伊红-苏木紫染色观察各组大脑海马区炎症细胞浸润与分布情况；Westernblotting检测各组小鼠大脑海马区Tau蛋白不同磷酸化位点(p-TauT181、p-Tau396、p-Taup404)的磷酸化水平变化。
【结果】
1.经PKH26标记后的SH-SY5Y细胞，随着AD-OMVs剂量增加聚集量增多，平均荧光值有增加趋势；随着AD-OMVs作用时间延长聚集量增多，平均荧光值也有增加趋势，最终确定最佳灌胃浓度为50μM，每隔24h进行灌胃。
2.连续给予小鼠OMVs/PBS灌胃8周后，三组小鼠体重变化无明显差异(P＞0.05)，而洗脸、抓挠行为明显多于对照组(P＜0.05)，排粪便粒数低于对照组与HL-OMVs组(P＜0.05)，而三组小鼠的直立行为无明显差异(P＞0.05)。
3.Y迷宫用于评估即时空间工作记忆，相比于HL-OMVs及对照组，AD-OMVs组明显降低了小鼠的自发交替率(P＜0.05)、Y迷宫新臂停留时间(P＜0.05)及Y迷宫穿越新臂的次数(P＜0.05)。
4.新物体识别用于评估小鼠的学习探索能力，相较于HL-OMVs及对照组，AD-OMVs组小鼠对于新物体的偏好降低，表现在AD-OMVs组对新物体探索的时间比例较HL-OMVs组及对照组降低(P＜0.05)。
5.在Morris水迷宫的定位航行实验中，与HL-OMVs及对照组相比，AD-OMVs组小鼠的逃避潜伏期时间延长，在第五天的逃避潜伏期显著延长(P＜0.01)；HL-OMVs及对照组逃避潜伏期随时间延长而逐渐缩短，在第五天的逃避潜伏期均显著缩短(P＜0.01)。
6.印度墨汁染色实验未见三者有明显差异(P＞0.05)，尚不能说明肠道菌群OMVs对肠动力有影响。
7.伊文思兰实验结果示：与HL-OMVs及对照组相比，AD-OMVs血脑屏障通透性增加；Westernblotting显示AD-OMVs中Claudin-5表达量减少(P＜0.05)。
8.Westernblotting对引起Tau蛋白不同磷酸化位点检测显示：与HL-OMVs及对照组相比，p-Tau396、p-Tau404和p-TauT181的磷酸化水平有不同程度升高(P＜0.05)。
【结论】
经AD来源的肠道菌群OMVs灌胃后，C57BL/6J小鼠血脑屏障通透性增加，小鼠学习记忆功能受损，Tau蛋白磷酸化水平的增加促进AD病理性进程。
第四部分阿尔茨海默病肠道菌群外膜囊泡引起tau蛋白异常磷酸化机制的初步研究
【目的】
本部分探讨肠道菌群OMVs对神经炎症、Tau蛋白磷酸化的可能机制，并在细胞水平上，通过对SH-SY5Y细胞给予AD-OMVs处理及相关抑制剂干预，进一步证实动物水平上所观察到的Tau蛋白磷酸化及机制，最终为AD的治疗及新药的开发提供进一步的理论依据。
【方法】
结合Elisa法和Westernblotting检测经肠道菌群OMVs灌胃处理后小鼠海马区炎性因子谱(IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB)的表达；结合Westernblotting、免疫荧光及免疫组化技术检测小鼠海马区小胶质细胞、星形胶质细胞及结肠区肠胶质细胞活化；Westernblotting检测小鼠海马区GSK3β(GSK3-β、p-GSK3-β)及CDK5-Calpain通路蛋白(Calpain1、Calpain2、P25、P35、CDK5)的蛋白表达；结合Westernblotting、CKK8和流式细胞仪技术，检测SH-SY5Y细胞及加入CDK5抑制剂Roscovitine、GSK3β抑制剂AR-A014418，对细胞增殖、细胞凋亡、Tau蛋白磷酸化和CDK5或GSK3β蛋白表达的影响。
【结果】
1.免疫荧光定性观察经肠道菌群OMVs灌胃后三组小鼠结肠区GFAP分布及表达量无明显差异。WesternBlotting定量检测显示，与对照组相比，AD-OMVs组小鼠结肠区GFAP蛋白表达量无明显差异(P＞0.05)。同样，HL-OMVs组小鼠结肠区GFAP蛋白表达量较对照组相比，亦不具有统计学意义(P＞0.05)。尚不能说明肠道菌群OMVs对小鼠结肠肠神经胶质细胞有活化作用。
2.免疫荧光定性观察经肠道菌群OMVs灌胃后三组小鼠海马区GFAP分布及表达量无明显差异。WesternBlotting定量检测显示，与对照组相比，AD-OMVs组小鼠海马区GFAP蛋白表达量无明显差异(P＞0.05)。同样，HL-OMVs组小鼠海马区GFAP蛋白表达量较对照组相比，亦不具有统计学意义(P＞0.05)。尚不能说明肠道菌群OMVs对小鼠海马区星形胶质细胞有活化作用。
3.WesternBlotting定量检测，与对照组相比，AD-OMVs组小鼠海马区Iba1蛋白表达量增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。而HL-OMVs组小鼠海马区Iba1蛋白表达量较对照组相比，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。这说明肠道菌群AD-OMVs对小鼠海马区小胶质细胞有活化作用。
4.经WesternBlotting检测AD-OMVs组小鼠大脑海马区的NF-κB表达较对照组增加，经Elisa检测IL-6、IL-1β、TNF-α较对照组表达量均增加(P＜0.05)，而HL-OMVs组较对照组相比无明显差异(P＞0.05)。
5.CDK5-Calpain通路蛋白检测结果示，与对照组相比较，AD-OMVs组小鼠海马区P25、P35、CDK5、Calpain1及Calpain2蛋白表达量明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而HL-OMVs组较对照组相比，CDK5通路蛋白表达量差异不明显(P＞0.05)。
6.与对照组小鼠相比较，AD-OMVs组小鼠的p-GSK3β表达量减少，差异具有统计学差异(P＜0.05)；而HL-OMVs组与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。GSK3-β的表达量在三组小鼠中无差异且两两之间无统计学意义(P＞0.05)。
7.经AD-OMVs处理后的SH-SY5Y使用GSK3β阻滞剂AR-A01441810μM处理后表现出GSK3-β抑制作用，而细胞增殖、凋亡及Tau蛋白磷酸化水平未见明显变化趋势。
8.经流式细胞仪及CKK8试剂盒检测示：非抑制剂组(Control组、AD-OMVs组及HL-OMVs组)较抑制剂组(Rosc组、AD-OMVs+Rosc组及HL-OMVs+Rosc组)细胞凋亡及增殖未见明显增加(P＞0.05)。体外实验验证AD-OMVs可通过影响CDK5酶活性而促进Tau蛋白磷酸化：与对照组相比，AD-OMVs能增加SH-SY5Y细胞中CDK5的表达水平(P＜0.05)，同时p-TauT181、p-Tau396和p-Tau404的表达水平也上调；Roscovitine组CDK5、p-TauT181、p-Tau396和p-Tau404与Control组相比，表达水平降低(P＜0.05)；在给予抑制剂Roscvitine后，AD-OMVs组和HL-OMVs组之间Tau蛋白磷酸化水平的差异不明显(P＞0.05)。
【结论】
AD与肠道菌群关系复杂，单一的通路尚不能完全阐明其病理机制。AD来源的肠道菌群OMVs可致小胶质细胞活性增加及神经炎性因子(NF-κβ、IL-1β、IL-6、TNF-α)表达上调。AD来源的肠道菌群OMVs在Tau蛋白不同磷酸化位点均有升高(p-TauT181，p-Tau396及p-Tau404)，结合体内外实验，最终确定Tau蛋白磷酸化水平升高是主要是通过CDK5通路发挥作用的。