论文部分内容阅读
第一部分一个新microRNA的克隆及其在破骨细胞分化过程中作用的研究目的：筛选新的小鼠破骨细胞特异性表达或优势表达的microRNA,研究其在小鼠体内不同组织和细胞的表达谱及在破骨细胞分化过程中的作用。方法：将小鼠原代成骨细胞与骨髓细胞共同培养获得原代破骨细胞,分离并克隆细胞内所有小RNA,并与已知的小RNA进行比对鉴定了一个新的microRNA,提交miRBase数据库注册后命名为miR-9718;应用Northern Blot测定小鼠不同组织及细胞miR-9718的表达情况；用M-CSF联合RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化,用Northern Blot及qRT-PCR测定miR-9718在RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中的表达模式；用pSilencer4.1-CMV载体构建miR-9718表达载体pre-miR-9718,并转染RAW264.7细胞,建立miR-9718过表达细胞模型,加入RANKL及M-CSF诱导其向破骨细胞分化,提取细胞总RNA用qRT-PCR法测定破骨细胞特异性标记物TRAP及NFATc1的mRNA表达水平,并行TRAP染色观察破骨细胞分化成熟情况；用2’甲氧基修饰的反义寡核苷酸anti-miR-9718转染RAW264.7细胞,构建miR-9718表达抑制模型,qRT-PCR法测定破骨细胞分化过程中TRAP及NFATc1的mRNA表达水平,并行TRAP染色观察破骨细胞分化成熟情况。结果：(1)在小鼠原代破骨细胞中克隆了一个新的microRNA,提交miRBase数据库注册后命名为miR-9718;(2)发现miR-9718选择性在破骨细胞及骨组织中高表达,而在小鼠其它组织和成骨细胞中几乎不表达；(3)RANKL及M-CSF诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中,]miR-9718的表达逐渐增加；(4)用pSilencer4.1-CMV载体成功构建了MiR-9718表达载体,并转染RAW264.7细胞,NorthernBlot证实RAW264.7细胞中miR-9718表达升高；(5)与对照相比,pre-miR-9718转染的RAW264.7细胞经RANKL及M-CSF诱导分化后,破骨细胞分化标记物NFATcl和TRAP的mRNA表达水平升高,TRAP阳性多核巨细胞数目显著增多；(6)与对照相比,anti-miR-9718转染的RAW264.7细胞经诱导向破骨细胞分化后,NFATcl和TRAPmRNA水平降低,TRAP阳性多核巨细胞明显减少。结论：在小鼠原代破骨细胞中鉴定了一个新的microRNA (miR-9718);在破骨细胞分化过程中miR-9718表达激活,支持破骨细胞的分化。第二部分miR-9718调控破骨细胞分化的作用机制研究目的：预测并验证miR-9718在破骨细胞分化中作用的靶基因,研究miR-9718调控RAW264.7细胞向破骨细胞分化的作用机制。方法：利用Rna22软件预测miR-9718在破骨细胞分化中作用的靶基因,筛选出PIAS3为其作用的可能靶基因；将包含预测的miR-9718结合位点的PIAS3CDS片段克隆到pGL3载体中构建野生型PIAS3荧光素酶报告基因(WT-pGL3-PIAS3),并用定点诱变试剂盒在miR-9718结合位点引入点突变,构建突变型PIAS3荧光素酶报告基因(MUT-pGL3-PIAS3)。将构建两种载体分别与pre-miR-9718或miR-C交叉转染RAW264.7细胞,检测荧光素酶活性。Pre-miR-9718单独转染RAW264.7细胞,(RT-PCR和Western Blot分别测定PIAS3mRNA和蛋白水平变化。PCR扩增小鼠PIAS3CDS全长片段,另用定点诱变试剂盒在扩增片段的miR-9718结合位点引入点突变(不导致编码氨基酸的改变),与pCDNA3.1载体结合分别构建野生型和突变型PIAS3表达载体。将构建的两种载体分别与pre-miR-9718或miR-C交叉转染RAW264.7细胞,用RANKL和M-CSF诱导其向破骨细胞分化后,qRT-PCR和Western Blot分别检测TRAP、NFATc1mRNA水平和PIAS3蛋白水平。Pre-miR-9718和anti-miR-9718分别转染RAW264.7细胞,RANKL和M-CSF诱导其向破骨细胞分化,qRT-PCR检测PIAS3mRNA水平及Western Blot检测NFATc1、MITF、c-FOS、 NF-κB和PIAS3蛋白表达水平。结果：(1)Rna22预测PIAS3可能为miR-9718在破骨细胞分化中作用的靶基因；(2)构建了野生型和突变型PIAS3荧光素酶报告基因,与转染miR-C的对照组相比,pre-miR-9718与WT-pGL3-PIAS3共转染组其荧光素酶活性受到抑制,而pre-miR-9718与MUT-pGL3-PIAS3共转染组荧光素酶活性无变化；(3)与转染miR-C的对照组相比,在RAW264.7细胞中单独转染pre-miR-9718抑制了PIAS3蛋白表达水平,而对PIAS3mRNA水平无明显影响；(4)pre-miR-9718转染RAW264.7细胞并诱导向破骨细胞分化后,NFATc1和TRAP mRNA水平显著升高,pre-miR-9718与WT-PIAS3-CDS表达载体共转染也能使NFATc1和TRAP mRNA水平升高,而pre-miR-9718与MUT-PIAS3-CDS表达载体共转染不能增加NFATc1和TRAP mRNA水平；(5)pre-miR-9718转染RAW264.7细胞并诱导向破骨细胞分化后,PIAS3mRNA水平无改变,而PIAS3蛋白表达减少,同时调节破骨细胞分化的重要转录因子TNFATc1、MITF、c-FOS和NF-κd3表达上调；而anti-miR-9718转染RAW264.7细胞并诱导向破骨细胞分化后,PIAS3蛋白表达增加,NFATc1、MITF、c-FOS和NF-κB表达下调。结论-miR-9718在转录后水平抑制PIAS3的表达,从而促进破骨细胞的分化。