论文部分内容阅读
本研究围绕鸭瘟病毒(DPV)的纯化、DPV gC抗原检测方法的建立和优化、DPVgC基因疫苗(pcDNA-DPV-gC)在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律及DPV弱毒疫苗在雏鸭体内的增殖和分布规律等4个方面开展以下研究：①DPV的纯化和超显微结构观察；②特异性检测DPV gC抗原的间接免疫组化和间接免疫荧光方法的建立和优化；③将pcDNA-DPV-gC分别以每只6μg、3μg、1μg基因枪轰击和200μg、100μg、50μg肌肉注射免疫20日龄的雏鸭；④将100μg脂质体/DNA基因疫苗和壳聚糖/DNA基因疫苗以肌注、口服和滴鼻等不同免疫途径免疫20日周龄的雏鸭；⑤在对照组中,将0.5mL DPV弱毒疫苗、100μg空白质粒和0.5mL生理盐水以皮下和肌注等不同免疫途径免疫20日龄的雏鸭,免疫后不同的时间点(4h、12h、1d、3d、5d、7d、2w、4w、6w和10 w),随机采集雏鸭的心、肝、脾、肺、肾、胰、脑、食道、胸腺、法氏囊、哈氏腺、十二指肠、盲肠、直肠和注射部位等组织,通过建立的间接免疫组化和间接免疫荧光方法检测pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律及DPV弱毒疫苗在雏鸭体内的增殖和分布规律。获得结果如下：1.利用差速离心和蔗糖密度梯度离心法纯化DPV,在电镜下可观察到多量、纯净的病毒粒子,纯化DPV具有典型的疱疹病毒的形态结构；将纯化DPV抗原多次免疫家兔可获得效价为1：32的兔抗DPV高免血清,经饱和硫酸铵粗提和High-Q柱纯化可获得较纯的兔抗DPV IgG。2.建立的间接免疫组化和间接免疫荧光方法具有主观,敏感性强,特异性高等优点,是进行DPV gC抗原检测和定位的可靠方法,pcDNA-DPV-gC免疫后1d即可在雏鸭体内检测到DPV gC蛋白且持续表达至10 w。3.基因枪轰击和肌肉注射免疫pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：各剂量免疫组第1d在肝、十二指肠、盲肠、直肠和注射部位检测到DPV gC蛋白,其中注射部位的阳性信号最强；第2w时各组织中的抗原表达量达到高峰,随着时间推移,阳性信号以不同速度逐渐衰减；第10w时各剂量免疫组仍在肝、法氏囊、脑、十二指肠、盲肠和直肠检测到持续表达DPV gC蛋白；而胰在所有时间点均未检出阳性信号；pcDNA-DPV-gC在不同组织的表达量也存在差异,肝、脾、法氏囊、脑、十二指肠、盲肠和直肠是DPV gC抗原主要的分布器官；阳性信号主要出现在肝脏的肝细胞、脾脏白髓或红髓淋巴细胞、法氏囊皮质或髓质淋巴细胞、脑皮质神经胶质细胞及肠黏膜上皮细胞和固有层细胞等部位。4.脂质体/DNA基因疫苗和壳聚糖/DNA基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：肌注组免疫后1d,肝脏、法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠出现阳性信号；滴鼻组免疫12 h,肺脏出现阳性反应细胞,免疫后1 d,哈氏腺和法氏囊检测到DPV gC蛋白；口服组免疫雏鸭12 h,食道出现中等强度的阳性染色,免疫后1d,法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠检测到DPV gC蛋白。其中肺脏、食道、哈氏腺、法氏囊、十二指肠、盲肠和直肠阳性信号较强,且持续时间长。阳性信号主要出现在肺脏和食道的上皮细胞、法氏囊和哈氏腺淋巴细胞、肠黏膜上皮细胞和固有层细胞等部位。5.不同剂量pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：不同剂量pcDNA-DPV-gC免疫雏鸭后,各组织的抗原表达量呈现的总体规律为6μg组>3μg组>1μg组,200μg组>100μg组>50μg组,说明基因疫苗pcDNA-DPV-gC的免疫剂量与DPV gC抗原的表达和分布呈现一定的正相关,但非等比例增长。6.不同免疫途径免疫pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：基因枪轰击和肌肉注射免疫pcDNA-DPV-gC后,DPV gC抗原可在雏鸭体内广泛表达和分布。免疫早期,基因枪组各组织的DPV gC蛋白表达量大于肌注组,尤其是皮肤的DPV gC蛋白表达量高于注射部位肌肉；免疫中期,基因枪组和肌注组的阳性信号都有强烈的增加,肌注组略高于基因枪组,但差别不明显；免疫后期,基因枪组和肌注组各组织的阳性信号不断减少,免疫后10 w大部分组织检测不到阳性信号。肌注、滴鼻和口服免疫脂质体/DNA基因疫苗和壳聚糖/DNA基因疫苗后,阳性信号在雏鸭不同组织的分布也产生一定的差异,如滴鼻组哈氏腺的阳性信号比肌注组和口服组高,口服组食道的阳性信号比肌注组和口服组高,DPV gC抗原在雏鸭各组织中的表达量和持续时间的总体规律为肌注组>滴鼻组>口服组。7.不同免疫佐剂包裹的pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律：免疫佐剂脂质体和壳聚糖都能促进pcDNA-DPV-gC在雏鸭体内抗原的表达和分布。壳聚糖/DNA组在雏鸭各组织中的阳性信号强度比脂质体组更强,持续时间也比脂质体组长。因此壳聚糖可作为pcDNA-DPV-gC免疫佐剂的首选。8.DPV弱毒疫苗在雏鸭体内增殖和分布规律：DPV弱毒疫苗免疫雏鸭后,第12 h肝脏和脾脏检测到DPV抗原,随着时间推移,阳性信号在1 d-7 d呈现上升趋势,2w-4 w达到最大值,但免疫后10 w仍可在雏鸭大部分组织检测到DPV抗原。鸭瘟疫苗病毒对雏鸭各组织表现出强烈的泛嗜性,肝脏,法氏囊,胸腺、十二指肠、盲肠和直肠是DPV主要的易感器官,而心脏、胰脏和食道的检测率低。