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目的:p53是重要的抑癌基因,作为“基因组卫士”,参与调控细胞生命活动中多种生物学机制,如细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞分化等,在维护基因组稳定性及维持细胞正常生理功能中发挥重要作用。研究表明,p53蛋白在维护基因组稳定性中参与调控多个DNA损伤修复途径。在BER途径和NHEJ途径中,p53通过其转录激活作用分别影响DNA polβ和ku70、ku80的表达参与损伤修复;在NER途径中,p53也可调控损伤识别因子XPC、DDB2的表达;p53蛋白还可通过蛋白质相互作用与Rad51、Rad54参与HR途径。在实验室前期研究中,我们发现XRCC1聚集至UV损伤位点受到PARP1和p53蛋白的调控,但具体的调控机制并不清楚。因此在本课题中,我们继续探讨了p53调控XRCC1聚集的分子机制,期望更好地了解p53参与紫外线损伤修复的分子机制。方法:1.应用多种PARP抑制剂在U2OS细胞、HCT116细胞中重复验证PARP1和p53蛋白对XRCC1在UV损伤位点聚集的影响;2.构建稳定表达FLAG-XRCC1(311-537)融合蛋白的U2OS细胞株,通过Co IP实验探究PARP1调控XRCC1聚集的机制;3.WB检测p53对XRCC1蛋白表达的影响;4.免疫荧光染色研究UV损伤后p53的聚集情况;5.通过domain分析和Co IP实验,研究p53蛋白调控XRCC1聚集的分子机制;6.通过p53蛋白上游信号抑制剂处理与免疫荧光染色实验,研究p53调控XRCC1聚集的上游信号通路;7.通过WB检测UV照射后细胞内γH2AX水平,分析PARP1和p53调控途径的关系。结果:1.PARP抑制剂3-AB和ABT-888处理U2OS、U2OS P53-KD细胞及HCT116及HCT116p53-/-细胞,经UV照射后,U2OS细胞与HCT116细胞中,XRCC1的聚集不受PARP抑制剂影响,而在P53-KD细胞与p53-/-细胞中,PARP抑制剂处理后,在紫外线损伤位点不能观察到XRCC1的聚集。2.对稳定表达FLAG-XRCC1(311-537)融合蛋白的U2OS细胞株进行UV照射和Co IP实验,该细胞株中XRCC1(311-537)与PARP1相互作用,UV照射后,该片段可被多聚腺苷核糖化修饰,且这一修饰被UV增强。3.U2OS、HCT116细胞中p53对UV损伤后XRCC1蛋白表达没有明显影响。XRCC1蛋白的表达在U2OS、P53-KD、HCT116及p53-/-对照组及UV处理组中没有明显差异。4.对U2OS细胞、HCT116细胞进行UV照射,发现细胞受到紫外线刺激后产生DNA损伤,p53蛋白可通过某种方式聚集至损伤位点。5.对表达FLAG-XRCC1(1-310)、FLAG-XRCC1(311-537)融合蛋白的U2OS稳转细胞株进行Co IP实验,以PCNA、PARP1为阳性对照,未发现p53与XRCC1蛋白1-310、311-537片段有直接相互作用。6.应用ATM、ATR、DNA-PK等p53上游信号的抑制剂BEZ335、Ku-55933与3AB共同处理U2OS细胞,XRCC1在损伤位点的聚集没有明显改变。7.WB检测U2OS、HCT116细胞中PARP1及、或p53调控通路失活后,UV照射后0h、1h、4h及8h时细胞中γH2AX水平。在UV照射后的1h,4h,8h,与U2OS组相比,U2OS+3AB、P53-KD、P53-KD+3AB组γH2AX量均有显著增加,但后三组间差异并不显著。结论:1.XRCC1参与UV损伤修复受到PARP1和p53蛋白协同调控;2.UV照射后,XRCC1在损伤位点的聚集受到PARP1的多聚腺苷核糖化修饰调控;3.UV损伤后,p53聚集至损伤位点参与修复,可能通过蛋白质相互作用调控XRCC1的聚集。