论文部分内容阅读
【研究背景与目的】甲醛(formaldehyde, FA)是化学结构最简单的醛类分子，可通过增强细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成，引起氧化应激而产生神经毒性。内源性硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)作为第三种气体信号分子，是机体内重要的神经保护因子和抗氧化剂。因此，我们推测甲醛通过抑制H2S生成而产生神经毒性。同时，有文献证实在中枢神经系统中过量一氧化氮(Nitric oxide, NO)可抑制神经细胞内硫化氢(H2S)合酶胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-bata-synthase, CBS)的活性。因此，我们推测甲醛可促进NO过度生成而抑制硫化氢的生成，进而产生氧化应激和神经毒性。为此，本课题将以甲醛损伤PC12细胞为甲醛神经毒性的细胞模型，探讨甲醛是否通过促进NO过度生成而抑制H2S的生成，进而产生氧化应激和神经毒性。【方法】以甲醛损伤PC12细胞为甲醛神经毒性细胞模型，采用trypan blue dye exclusion、MTT、Cell Counting Kit-8检测PC12细胞的活力；Hoechst33258染色和PI染色流式细胞术检测细胞凋亡；DCFH-DA染色法检测细胞内ROS累积情况；亚甲基蓝显色法检测PC12细胞上清液中H2S的含量和PC12细胞CBS的活性；Western Blot检测PC12细胞CBS蛋白的表达；利用RNA干扰技术沉默PC12细胞CBS的表达；一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)试剂盒检测细胞内NOS活性；NO试剂盒检测细胞培养基中NO的水平。【结果】1.甲醛对PC12细胞的活力和内源性H2S生成的抑制作用甲醛(60、120、240μmol/L)处理PC12细胞24h后，细胞活力和细胞培养基中H2S含量呈浓度依赖性地减少，甲醛(120μmol/L和240μmol/L,24h)可降低细胞H2S生成酶CBS的表达及其活性，提示甲醛的神经毒性可能与其抑制CBS表达和活性、降低H2S生成有关。2.抑制内源性H2S的生成加剧甲醛对PC12细胞的毒性作用利用RNA干扰(RNAi)技术，将CBS-siRNA转染PC12细胞后，CBS的表达显著降低，H2S的产生明显减少。我们进一步发现，CBS-siRNA与甲醛(120μmol/L)共处理24h后，可加重甲醛对PC12细胞活力的抑制作用、加剧甲醛对PC12细胞凋亡和ROS累积的诱导作用，表明抑制H2S生成可加重甲醛的神经毒性。3.甲醛通过促进NO生成而抑制PC12细胞内H2S的生成甲醛(120、240μmol/L)处理PC12细胞24h后，细胞NOS的活性明显增强，同时细胞上清液中NO含量明显增加。提前30min给予160μmol/L的非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)可显著抑制甲醛对PC12细胞NOS的激活作用、减轻甲醛对NO生成的促进作用、降低甲醛对PC12细胞CBS表达和活性以及H2S生成的抑制作用，表明甲醛可通过过度激活NOS、促进NO大量生成而抑制H2S的生成。4.抑制NO的生成可拮抗甲醛的神经毒性提前30min给予160μmol/L的ADMA可显著减轻甲醛(120μmol/L,24h)对PC12细胞的细胞毒性作用，抑制甲醛(120μmol/L,24h)诱导PC12细胞凋亡，降低甲醛(120μmol/L,24h)对PC12细胞ROS的积累作用，表明抑制NO的生成可拮抗甲醛的神经毒性。【结论】1.甲醛对PC12细胞的损伤作用与其抑制胱硫醚-β-合成酶的表达和活性、减少内源性硫化氢的生成密切相关。2.甲醛通过激活NOS、促进NO生成而抑制内源性H2S生成。