论文部分内容阅读
DNA干扰（DNA interference,DNAi）是一种由同源性DNA引发的靶标基因沉默的现象,该现象存在于多种生物中。原核生物的DNAi是由Argonaute蛋白介导的,真核生物的DNAi机理则没有具体的报道。小菜蛾Plutella xylostella属鳞翅目菜蛾科,是十字花科蔬菜的害虫。目前课题组已在P.xylostella中发现了DNAi的现象。因此,本研究以P.xylostella为研究对象,探究小菜蛾Argonaute蛋白（PxAgo）在DNAi中可能起到的作用,利用转录组学和蛋白质谱技术,挖掘在DNAi过程中参与DNA绑定的蛋白。主要结果如下:1.在P.xylostella中鉴定到了4个Argonaute蛋白,明确了各个基因的序列特征、亲缘关系以及时空表达模式。（1）利用RACE技术克隆鉴定到4个PxAgo家族基因PxAgo1、PxAgo2、PxAgo3和Px Piwi,其中PxAgo1和PxAgo2属于AGO亚家族,PxAgo3和Px Piwi属于PIWI亚家族。PxAgo1有四个可变剪接体,共编码两种蛋白PxAgo1 X1和PxAgo1 X2,两种蛋白均含有Argonaute linker 1结构域、N端结构域、PAZ结构域和Piwi结构域;PxAgo2无可变剪接体,编码的蛋白具有与PxAgo1一样的结构域;PxAgo3也无可变剪接体,编码的蛋白含有PAZ结构域和Piwi结构域;Px Piwi有两个可变剪接体,共编码两种蛋白Px Piwi X1和Px Piwi X2,具有与PxAgo3一样的结构域。（2）与其他昆虫的Argonaute蛋白家族系统发育树结果表明,PxAgo1 X1、PxAgo1 X2和PxAgo2分布在AGO亚家族分支上,且PxAgo1的两个蛋白与PxAgo2分布在AGO亚家族分支的不同亚支上;Px Piwi X1、Px Piwi X2和PxAgo3分布在PIWI亚家族分支上,且Px Piwi的两个蛋白与PxAgo3分布在PIWI亚家族分支的不同亚支上;PxAgo蛋白均与鳞翅目昆虫对应的Argonaute蛋白聚在了一起。与部分的真核生物以及原核生物的Argonaute蛋白家族系统发育树结果表明,一部分原核生物的Argonaute蛋白与真核生物的Argonaute蛋白聚到了一支;昆虫的Ago2蛋白与其他真核生物的AGO亚家族蛋白分化成两支;与昆虫的Piwi蛋白相比,Ago3蛋白与其他真核生物的Piwi亚家族蛋白更接近,聚成一支。（3）PxAgo基因的时空表达模式结果表明,PxAgo1、PxAgo2、PxAgo3和Px Piwi均在蛹期高表达;PxAgo2在中肠中的表达量最高,PxAgo3和Px Piwi则都是在精巢中的表达量最高;在同一个组织中,PxAgo2和Px Piwi的表达量比PxAgo1和PxAgo3的表达量高。2.明确了小菜蛾细胞的DNAi现象,并利用链霉素-生物素法捕获了DNA的结合蛋白。（1）细胞转染实验表明,小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的短单链DNA（ss DNA）以及鞣化激素α亚基基因PxBursα的ss DNA和长链PCR产物均会抑制小菜蛾细胞对应靶标基因的表达,引起DNAi现象。（2）对捕获到的DNA结合蛋白分析发现,捕获的蛋白中没有PxAgo成员;对各自剔除对照的两个实验组取并集一共发现了197个蛋白;这197个蛋白在GO注释的分子功能中主要分布在绑定行为、催化活性和结构分子活性这3个类别上,GO主要显著富集在翻译以及各种核糖体相关的条目上,KEGG注释最多的通路是遗传信息处理的翻译通路,显著富集到核糖体通路和全身性红斑狼疮通路,Pfam分析发现一共有20个蛋白含有ss DNA结合蛋白必须的OB-fold结构。3.检测了注射PxBursα外显子短双链DNA片段的小菜蛾转录组,并结合DNA的Pull-down分析筛选到46个候选蛋白。（1）转录组数据表明,以H2O为对照时共有显著差异表达基因220个,以EGFP为对照时共有显著差异表达基因261个,其中相同的基因有32个。GO功能注释显示,以H2O为对照筛选的差异表达基因和以EGFP为对照筛选的差异表达基因都主要分布在分子功能的绑定活性和催化活性以及生物过程的代谢过程;KEGG通路注释显示,含有差异表达基因数目最多的两条通路是环境信息处理的信号传导和代谢的global and overview maps两条通路。（2）筛选到的46个候选蛋白中,有12个具有OB-fold结构的蛋白和21个具有ds DNA结合典型结构域的蛋白,其中有4个RNA或DNA解旋酶、2个RNA或DNA聚合酶、3个DNA复制相关的蛋白、5个翻译或转录相关的蛋白、3个组蛋白相关的蛋白以及3个羧化酶相关的蛋白。综上所述,本研究鉴定了小菜蛾的Argonaute家族成员,同时利用转录组测序和DNA-蛋白互作的方法,筛选了可能参与DNAi现象的蛋白,为后续DNAi的机理研究奠定了基础。