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研究背景及目的非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)是全球范围内常见的恶性肿瘤,约占肺癌总数的85%11]。肺腺癌是非小细胞肺癌的一种重要的病理类型,发病率呈逐年上升趋势[2]。肿瘤细胞免疫逃逸是目前的研究热点,程序性死亡因子1(programmed death-1,PD-1)及其配体程序性死亡因子配体 1(programmed death ligand 1,PD-L1)是参与肿瘤免疫逃逸的重要分子,在多种肿瘤中高表达[3]。目前针对 PD-1/PD-L1 免疫检查位点的单抗如 nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab 等已应用于非小细胞肺癌临床试验和治疗,并取得了令人欣喜的临床效果[4-6],但仍存在一些急需解决的问题,如较多患者对药物没有反应性、影响药物疗效的机制不明确等[7-8]。因此,研究肿瘤中PD-L1表达特征和相关调控机制及其在PD-1/PD-L1阻断治疗中的预测和预后价值具有重要临床意义[9]。缺氧是实体瘤微环境的重要生物学特征[10],广泛存在于大多数实体瘤中的缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一种转录调节因子,由HIF-1α亚单位和HIF-1β亚单位组成,其中HIF-1α是氧调节单位,是调控肿瘤细胞多种基因转录和蛋白表达适应缺氧环境的重要因子。近两年来,有研究报道缺氧条件下HIF-1α可调控PD-L1的表达[11-14]。然而,肺腺癌中PD-L1的表达是否受缺氧微环境及HIF-1α调控影响尚无报道。本实验拟通过免疫组化法分析临床肺腺癌组织标本中HIF-1α、PD-L1表达相关性,并利用癌症基因组图谱计划(the cancer genome atlas,TCGA)数据库验证组化结果,及分别用CoCl2模拟化学性缺氧和siRNA沉默HIF-1α处理人肺腺癌细胞系,探究肺腺癌中HIF-1α对PD-L1表达的调控作用和机制。研究方法应用免疫组织化学方法检测99例肺腺癌组织中HIF-1α、PD-L1的表达;利用TCGA数据库分别分析230名肺腺癌患者[15]和178名肺鳞癌患者[16]数据组中HIF-1αPD-L1 mRNA表达相关性;CoCl2模拟化学性缺氧分别处理人肺腺癌细胞NCI-H1975和 HCC827,实验分为 Normal 组、CoCl2 组,qRT-PCR 检测 HIF-1α、PD-L1 mRNA表达,Western blotting检测HIF-1α、PD-L1蛋白表达;siRNA-HIF-1α分别瞬时转染人肺腺癌细胞 NCI-H1975 和 HCC827,分为 NC 组、siR-HIF-1α 组,qRT-PCR、Westem blotting检测转染效率及PD-L1 mRNA和蛋白的表达。结果1.免疫组化检测结果显示,肺腺癌组织中HIF-1α阳性表达呈棕褐色细颗粒,染色定位于细胞核。PD-L1阳性表达呈棕黄色颗粒,染色定位于细胞膜和(或)细胞质。99例肺腺癌组织中,HIF-1α、PD-L1 阳性率分别为47.48%(47/99)、34.34%(34/99)。2.99例肺腺癌组织中,HIF-1α表达水平与患者年龄和临床分期有关(P<0.05),与性别、吸烟状况、肿瘤大小、淋巴结转移均无关(P>0.05)。3.99例肺腺癌组织中,PD-L1表达水平与患者临床分期有关(P<0.05),与年龄、性别、吸烟状况、肿瘤大小、淋巴结转移均无关(P>0.05)。4.Spearman相关分析法分析免疫组化结果显示,肺腺癌中HIF-1α蛋白表达和PD-L1蛋白表达正相关(r=0.292,P<0.01)。进一步分析TCGA数据库中230名肺腺癌患者组HIF-1α和PD-L1 mRNA表达水平,发现与组化结果一致,肺腺癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表达正相关(r=0.467,P<0.001)。此外,我们还分析了 TCGA数据库中178名肺鳞癌患者组HIF-1α和PD-L1 mRNA表达水平,发现肺鳞癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA 表达无相关性(r=0.108，P＞0.05)。5.CoC12模拟化学性缺氧处理肺腺癌细胞NCI-H1975 24h后,与Normal组相比,CoC12组HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P<0.05),PD-L1 mRNA及蛋白表达水平随之明显升高(P<0.01);CoCl2模拟化学性缺氧处理肺腺癌细胞HCC827 24h后,与Normal组相比,CoC12组HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P<0.05),PD-L1 mRNA及蛋白表达水平随之明显升高(P<0.05)。6.siRNA转染沉默肺腺癌细胞NCI-H1975 HIF-1α基因,48h后检测转染效率确保HIF-1α基因表达下调,进一步检测PD-L1表达变化发现,siR-HIF-1α组与NC组相比,PD-L1mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);siRNA转染沉默肺腺癌细胞HCC827 HIF-1α基因,48h后检测转染效率确保HIF-1α基因表达下调,进一步检测PD-L1表达变化发现,siR-HIF-1α组与NC组相比,PD-L1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论本研究发现在临床肺腺癌组织标本中HIF-1α和PD-L1蛋白表达正相关,进一步在TCGA数据库中验证了肺腺癌中HIF-1α和PD-L1 mRNA表达正相关,并在肺腺癌细胞实验中证明了 HIF-1α对PD-L1的表达起到调控促进作用,揭示了肺腺癌肿瘤缺氧微环境导致肿瘤免疫逃逸的一种重要机制。