一、研究背景及目的膀胱癌的发病率位于男性实体肿瘤的第6位,居我国泌尿生殖系肿瘤的首位。在膀胱癌中,约75%的是非肌层浸润性肿瘤(Non-Muscle Invasion Bladder Cancer,NMIBC),对于这类患者通常采取经尿道切除手术联合术后膀胱灌注化疗或BCG的治疗策略。最新的EAU指南指出,肿瘤的自身特点包括数目多少、直径大小、分化程度、TNM分期,是否伴有原位癌,初发或复发都是影响NMIBC复发危险因素,这也就导致NMIBC术后5年复发率高达78%。其中,约20%-30%NMIBC会进展为肌层浸润性膀胱肿瘤(Muscle Invasion Bladder Cancer,MIBC),在这些患者中有50%在行根治术的两年内发生远处转移。然而,对于局部晚期或者晚期的MIBC患者,目前仍然以吉西他滨联合顺铂(GC方案)治疗为标准的治疗方式,但膀胱癌的病死率在近15年以来仅仅下降了 1.5%,这远远低于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等实体肿瘤的下降幅度。究其原因可以归结为以下三个方面1、GC方案的疗效有限;2、肿瘤细胞的耐药;3、缺乏高效的靶向治疗药物。肿瘤进展及耐药机制研究是寻找有效靶向治疗药物的前提和基础,然而,截止目前膀胱癌的进展及耐药机制尚不十分明确。因此,挖掘与膀胱癌发生、发展显著相关的新的分子标志物,并探索它们在膀胱癌进展和耐药中的作用机制,对于扩宽靶向治疗药物的研究思路具有重要的理论意义。长链非编码RNA是超过200bp单链核苷酸序列的统称,虽然其不具有编码蛋白质的功能,但可以通过表观遗传学水平、转录水平及转录后水平三个层面参与基因的调控,进而影响肿瘤发生、发展、转移、耐药等恶性进展过程。以最经典的lncRNA UCA1(Urothelial Carcinoma-associated 1)为例,一项 meta 分析结果显示尿液 UCA1诊断膀胱癌的敏感性为0.83(95%CI,0.77-0.88),特异性为0.87(95%CI,0.73-0.94),受试者曲线下面积为0.88(95%CI,0.85-0.91),这提示尿液UCA1是一种较为理想的膀胱癌无创诊断标记物,在膀胱癌患者的普查、随访、早期诊断等临床工作中具有潜在的应用价值。更为重要的是,研究发现UCA1在膀胱癌中是显著高表达的,沉默UCA1的表达会显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,使细胞的抗凋亡能力下降,对吉西他滨的药物敏感性升高。深入研究发现UCA1可以激活转录因子CREB,后者会与miR-196a-5p的启动子区域结合促进其表达,以UCA1-CREB-miR-196a-5p调控轴的形式影响膀胱癌的进展和耐药过程;还可以通过激活Wnt信号通路增强膀胱癌细胞对化疗药物的耐受力。最近有报道发现lncRNA可能还与膀胱癌细胞的干性密切相关。例如,吉西他滨作用于膀胱癌细胞的过程中,TGFβ1表达会随着治疗时间的延长而逐渐升高,TGFβ1高表达抑制lncRNA-LET,后者会增加NF90的结构稳定性,最终导致miR-145表达下降,引起膀胱癌细胞干性的增强和耐药的发生。由此可见,失调lncRNA表达贯穿于膀胱肿瘤发生、发展的各个环节,而且可以在膀胱癌恶性进展及耐药过程中发挥重要的调控作用,因此挖掘新的失调表达的lncRNA分子,并探索其参与肿瘤恶性进展的作用机制具有广阔的临床转化应用前景。基于目前关于lncRNA的机制研究中,竞争性内源“ceRNA”机制是最常见的一种类型,也是被广泛认可的一种调控机制,即一些非编码的RNA存在与microRNA的结合位点,在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对靶基因的抑制,从而提高靶基因的表达水平。有研究发现,UCA1与miR-582-5p存在竞争性结合关系,二者呈显著负相关,而且不管敲减UCA1或者过表达miR-582-5p都会引起miR-582-5p的靶基因ATG7的表达下降,ATG7介导的细胞自噬过程也会受到抑制。然而,一个靶基因可以受到不只一条“ceRNA”网络调控,Claudin-4在胃癌中表达上调而且与不良预后密切相关,它会增强AGS,HGC-27和SGC-7901癌细胞系增殖、侵袭及EMT过程,而这些生物学行为的改变能够被miR-596和miR-3620-3p 逆转,lncRNA-KRTAP5-AS1 与 lncRNA-TUBB2A 在胃癌就可以扮演“ceRNA”角色中止这两条miRNAs的逆转过程,从而增强Claudin-4的促癌能力,这两条lncRNA也被认为是胃癌的潜在的生物标志物和治疗靶标。因此,从“ceRNA”角度揭示lncRNA对靶基因的调控是可行的。本研究的目的就是挖掘与膀胱癌发生、发展密切相关的新的lncRNA分子标志物,基于其细胞定位及分布属性特征,探索其在膀胱癌进展和耐药中的作用机制,拓宽膀肮癌进展及耐药机制的研究思路,以期为解决膀胱癌耐药及精准治疗提供可参考的理论依据。二、研究方法1.通过对10对膀胱癌组织与癌旁正常组织的高通量转录组测序,采用Aov,DESeq2,StudentT,Wilcox,edgeR等5 种统计学方法,参考FDR值、P值、log2FoldChange值,筛选出显著差异表达的候选lncRNA分子。2.对于候选lncRNA之一 ln387265进行5’RACE和3’RACE扩增转录本的全长序列,并利用PhyloCSF、ORF-finder、CPAT生物学技术方法验证ln387265的非蛋白编码特性。3.根据ln387265序列信息合成FISH探针,检测ln38276在膀胱癌细胞系中的定位。4.采用核质分离实验,进一步探索ln387265在膀胱癌细胞系中核质表达相对比例,为后续机制研究提供思路。5.RT-qPCR检测ln382765在膀胱癌组织与正常组织中的表达水平,并比较不同病理分期,不同病理分级,初发与复发组织中的表达差异;对ln387265表达水平与临床病理特征进行相关性分析;检测不同膀胱癌细胞系与正常尿路上皮细胞系中表达差异。6.构建慢病毒介导的ln3827265-shRNA膀胱癌细胞系及ln387265过表达膀胱癌细胞系。7.体外实验研究敲减或过表达ln387265表达后对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学行为的影响。8.将稳转细胞株种植于裸鼠皮下,观察并记录不同处理组裸鼠皮下瘤体的生长曲线,比较各组之间的生长差异;IHC检测凋亡及增殖相关指标的变化情况。10.RT-qPCR检测梯度时间处理膀胱癌细胞系后ln382765及耐药基因的表达变化趋势。11.检测并比较不同处理组细胞系对吉西他滨药物敏感性(IC50)的影响。12.WB检测改变ln387265表达后,耐药及凋亡基因的表达变化。13.采用相关性分析、RegRNA2.0,TargetScan数据库,预测ln387265的靶基因及存在竞争性结合关系的miRNA。14.荧光素酶报告基因,RNA pull down实验验证ln387265与靶基因及预测miRNA的竞争性结合关系。15.RT-qPCR检测改变ln387265表达后,预测靶基因及miRNA的表达水平变化。16.在利用ln387265敲减及过表达稳转株的基础上,同时借助miRNA minic及inhibitor改变竞争性结合miRNA的表达水平,观察膀胱癌细胞系的增殖、迁移及侵袭能力的变化。17.利用高通量测序技术,检测改变ln387265在膀胱癌细胞中的变化后转录组水平上的变化,在此基础上,进行GO和KEGG富集分析,寻找显著变化的肿瘤相关的调控通路。18.WB验证显著变化调控通路上相关蛋白的表达变化情况。19.IHC验证上述通路中的相关蛋白在裸鼠皮下成瘤瘤体组织中的表达变化。20.勾画ln387265在膀胱癌发生、发展中完整的调控机制示意图。三、研究结果1.高通量测序结果发现了多条显著差异表达lncRNA分子,结合不同统计学算法及高级分析结果,按照FDR值<0.5、P值<0.5、log2FoldChange>2的筛选标准,最终选定ln3827265作为研究对象。2.RACE扩增,通过ORF-finder、NCBI blast后,未发现同源氨基酸残基序列,证实ln387265不具有蛋白编码功能。3.通过FISH实验发现ln387265多定位于细胞质中。4.通过核质分离实验进一步证实ln382765在细胞质中的分布比例显著高于细胞核,与FISH结果一致说明ln387265属于胞质lncRNA。5.RT-qPCR结果显示ln382765在膀胱癌肿瘤组织中的表达水平高于癌旁正常组织,而且高分级高于低分级,复发高于初发组织;相关性分析显示,ln387265与膀胱癌肿瘤分期、分级及是否复发呈显著正相关,即高分期、高分级及复发组织ln33827265显著高表达;ln387265在T24、T921膀胱癌细胞系中的表达水平较高,在J82膀胱癌细胞系中的表达水平较低,在膀胱癌细胞系中的表达水平均高于正常尿路上皮癌细胞系 SVHUC。6.成功构建ln387265-shRNAT24、T921稳定转染细胞系,敲减组ln387265表达水平显著低于阴性对照组;成功构建ln387265过表达J82稳定转染细胞系,过表达株ln387265表达水平显著高于与阴性对照组。7.功能学实验显示ln387265敲减组细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移及侵袭能力显著下降;流式细胞学显示,敲减组细胞的凋亡比例高于对照组细胞。8.功能学实验显示ln387265过表达组细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移及侵袭能力显著增强;流式细胞学显示,过表达组细胞凋亡细胞比例低于对照组细胞。9.裸鼠皮下成瘤显示,敲减组细胞皮下成瘤能力、生长能力、Ki-67蛋白表达低于阴性对照组,凋亡相关蛋白Casp3表达高于阴性对照组;过表达组细胞皮下成瘤能力、生长能力、Ki-67蛋白表达高于阴性对照组,凋亡相关蛋白Casp3表达低于阴性对照组。10.RT-qPCR检测发现随着吉西他滨药物处理时间的延长,膀胱癌细胞中ln387265及耐药基因GTSE1的表达逐渐升高。11.ln378265敲减组膀胱癌细胞系的IC50值低于阴性对照组,对吉西他滨的药物敏感性升高;ln387265过表达组膀胱癌细胞系的IC50值高于阴性对照组,对吉西他滨的药物敏感性下降。12.ln387265敲减组细胞系中耐药基因GTSE1的表达下降,凋亡基因Casp3,Casp7的表达显著上升;而过表达组细胞耐药基因GTSE1的蛋白表达显著升高,而Casp3,Casp7的表达有所下降。13.相关性分析及数据库预测提示ln387265与miRNA-608可能存在竞争性结合惯性系,GTSE1可能是ln387265/miRNA-608的下游靶基因。14.荧光素酶报告基因显示,ln387265与miRNA-608存在竞争性结合关系,miRNA-608与GTSE1存在竞争性结合关系。15.RNA pull down结果提示ln387265与GTSEl mRNA之间存在结合关系。16.RT-qPCR检测发现敲减ln387265表达后,T24膀胱癌细胞系中miRNA-608的表达上升,而GTSE1的表达有所下调;过表达ln387265表达后,J82膀胱癌细胞系中miRNA-608表达显著上调,而GTSE1的表达有所上升。17.高通量转录组测序KEGG分析结果显示,与阴性对照组相比,过表达组细胞表达变化基因在NF-kB signaling pathway上出现显著富集。18.WB结果发现ln387265过表达细胞中NF-Kb/p65,及下游的增殖相关基因Cyclin D1,抗凋亡相关基因Survivin,肿瘤转移相关基因MMP-9蛋白的表达高于阴性对照组,而p53蛋白表达则低于阴性对照组;而ln387265敲减组细胞与阴性对照组相比,NF-Kb/p65,Cyclin D1,Survivin,MMP-9蛋白表达下降,而p53蛋白表达下降。19.IHC 结果提示 NF-Kb/p65,Cyclin D1,Survivin,MMP-9,p53 蛋白在敲减组瘤体组织、过表达组瘤体组织及对应阴性对照组瘤体组织中的表达情况与WB结果一致。20.在膀胱癌中高表达的ln387265竞争性吸附miRNA-608,使miRNA-608的表达水平下降,以抑制miRNA-608对GTSE1表达的干扰作用,从而促进GTSE1在膀胱癌中的表达升高。细胞核中GTSE1的高表达促进p53由核内向核外转移,降低细胞核内p53蛋白水平,p53与NF-kB存在相互作用关系,p53在核内低表达将促进NF-kB信号通路的激活,进而导致p65与核内DNA上的特异序列相结合,从而启动或增强肿瘤相关基因的转录,诱导下游基因Cyclin D1,Survivin,MMP-9表达,引起与这些基因相关的肿瘤增殖,转移,耐药,及抗凋亡能力增强,促进膀胱肿瘤的恶性进展过程。四、研究结论长链非编码RNA n387265在膀胱癌组织中显著高表达,与膀胱癌的高分期、低分化及复发有显著相关性;ln387265在膀胱癌中发挥原癌基因的功能,有助于增强膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭及抗凋亡能力,降低对吉西他滨的药物敏感性;在机制上,ln387265可能通过竞争性结合miRNA-608促进GTSE1表达,进而诱导NF-kB通路的活化,增强膀胱肿瘤的恶性进展过程。该研究揭示了 ln387265在膀胱癌发生、进展中的作用机制,为膀胱癌靶向治疗提供了新的思路,具有潜在的临床转化价值。