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目的： 据统计，每年新增的癌症患者超过900万，其中有30％-50％伴有不同程度的疼痛，而骨癌痛(cancer-induced bone pain，CIBP)则是慢性癌痛最为常见的一种，骨癌痛通常由原发性骨肉瘤或继发于乳腺癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤转移所致。由于骨癌痛的机制尚不明了，在治疗骨癌痛方面尚无好的方法。因此探讨骨癌痛的产生与发展机制，寻找有效的控制骨癌痛的方法，成为当前亟待解决的问题。 近年来脊髓胶质细胞与疼痛的关系受到广泛关注。当中枢神经系统受损或外周慢性炎性刺激或机械刺激下，初级传入神经末梢释放神经递质如SP等，通过特异性受体激活胶质细胞，使之发生肥大、增生，并伴有功能改变，激活的胶质细胞能产生和释放大量细胞因子、炎性介质和神经活性物质，作用于脊髓背角痛觉传递神经元，使其处于超敏化状态，产生痛觉改变或痛觉过敏。 神经调节因子(Neuregulin1，NRG1)属表皮生长因子类蛋白，在多种组织都有表达，NRG1直接与酪氨酸激酶型受体ErbB3或ErbB4结合，然后通过ErbB3或ErbB4与ErbB2构成异二聚体，能激活ErbB2信号通路，诱导广泛的生物学功能，包括神经和心脏发育、神经突触的形成和可塑性等。突触可塑性变化是中枢敏化的基础，而中枢敏化又是疼痛产生的主要原因之一。近年研究发现，小胶质细胞上表达ErbB2、3和4受体，外周神经损伤时初级传入中枢表达NRG1增加，同时脊髓背角小胶质细胞增殖和活化导致痛觉过敏。但骨癌痛中是否存NRG1-ErbB2异常表达，其与小胶质细胞的关系及是否与痛觉过敏有关，目前尚未见报道。 本研究通过大鼠胫骨注射Walker256乳腺癌细胞建立大鼠骨癌痛模型，旨在探讨NRG1-ErbB2受体信号通路在骨癌痛中的作用及机制，从而为寻找新的有效的治疗骨癌痛的方法奠定基础。 实验材料： 1、实验动物 雌性SD大鼠，初始体重200-220g 2、主要试剂及药品 Walker256大鼠乳腺癌瘤细胞中国医学科学院肿瘤研究所 PD168393 Calbiochem HRG1β(ab50277) Abcam 鼠抗NRG1抗体(SC-57384) Santa Cruz 兔抗ErbB2抗体(ab2428) Abcam 兔抗p-ErbB2抗体(ab47755) Abcam 鼠抗GFAP Sigma 鼠抗OX42 Abcam 兔抗p-AKT1 Santa Cruz 兔抗p-P38MAPK Santa Cruz Anti-GAPDH Sigma IL-1β ELISA试剂盒 R&D 3、主要仪器 Von Frey纤毛美国Stoelting公司 BME-410A热痛刺激仪中国医学科学院生物工程研究所 PE10导管宁波市安来软件科技有限公司 ELX-800酶标仪美国BioRad公司 LightCycler定量PCR仪美国Roche公司 实验方法 1、动物模型 在右侧胫骨中上1/3处将皮肤切开约1 cm小口，小心暴露胫骨，先用5 ml注射器针头在胫骨钻孔，用25μl微量注射器经针孔进入骨髓腔，缓慢注入10μl含Walker256的PBS细胞悬液，共含癌细胞1×105个，注射时间为2min，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水冲洗切口，皮肤分层缝合，在伤口处涂金霉素眼膏。假手术组大鼠右侧胫骨上段注入等体积的灭活细胞，其余操作同各cancer组。 2、鞘内置管 L3～L4棘间椎管内植入PE10导管，导管插入0.5～1cm。 3、实验动物分组及检测 (1)实验一 Sham组（假手术组）与CIBP组:于造模后3、6、10、14、21d进行疼痛行为学测试，放射线，病理切片;利用Western blot、RT-PCR检测NRG1、ErbB2蛋白及mRNA表达变化趋势，ELISA检测IL-1β的变化趋势;利用免疫组化方法进一步明确星形胶质细胞标记物胶质细胞纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidicprotein，GFAP)及小胶质细胞标记物OX-42在脊髓背角的分布及表达情况，骨癌痛时大鼠脊髓背角GFAP及OX-42的变化趋势。 (2)实验二 Sham组:假手术组大鼠;CIBP组:构建CIBP模型;CIBP+DMSO组:构建CIBP模型后，鞘内注入DMSO10μl; CIBP+ PD168393:构建CIBP模型后6天，鞘内注入PD16839310μg(5％DMSO稀释，1μg/μl,10μl)，每日1次，连续9天。利用Western blotting、 RT-PCR检测对NRG1、ErbB2、P38MAPK、AKT1蛋白及mRNA表达变化，ELISA检测IL-1β的变化。免疫组化观察PD168393对骨癌痛大鼠脊髓背角GFAP及OX-42表达的影响。 (3)实验三 Sham组:正常大鼠鞘内注入生理盐水10μl，每日1次，连续3天;HRG1β组:正常大鼠鞘内注入Neuregulin-β1 EGF domain(HRG1β，10μl，生理盐水稀释，0.4ng/μl)，每日1次，连续3天; HRG1β+ PD168393组:鞘内注入PD168393，10μg后1h，经鞘内注入HRG1β4ng，每日1次，连续3天。Western blotting、RT-PCR检测对ErbB2、P38MAPK、AKT1蛋白及mRNA表达变化，ELISA检测IL-1β表达变化。 结果： 1、CIBP组大鼠在接种walker256瘤细胞后第6天开始出现热缩足反应潜伏期(PWL)缩短和机械缩爪阈值(PWT)降低的趋势;接种后14天出现明显的痛行为学改变，提示大鼠胫骨接种walker256瘤细胞可导致大鼠同时出现机械性痛敏和热痛敏。与对照组大鼠比较，CIBP组大鼠脊髓NRG1和ErbB2mRNA及蛋白表达显著增高，与痛行为学的变化相一致。同时骨癌痛诱导大鼠脊髓背角GFAP和OX42表达上调。 2、连续鞘内给予ErbB2受体抑制剂PD168393(10μg/10μl，i.t.，每日1次，连续9天):(1)显著抑制肿瘤导致的痛行为，ErbB2受体的活化、P38MAPK和AKT-1的磷酸化以及IL-1β的表达;(2)抑制骨癌痛诱导的脊髓背角GFAP和OX42表达的上调。 3、鞘内注射HRG1β可迅速诱发大鼠机械痛敏和热痛敏，PWT和PWL值均显著降低，NRG1、ErbB2、P38MAPK及AKT-1蛋白和mRNA的表达显著增加;而鞘内使用PD168393预处理可明显抑制HRG1β诱发的触觉异常痛敏和热痛敏，使PWT和PWL值显著升高，抑制ErbB2受体活化，同时P38MAPK、AKT-1蛋白活化及mRNA的上调也受到显著抑制。 结论： 1、NRG1/ErbB2在脊髓背角的激活促进了骨癌痛的发展与维持，鞘内给予外源性NRG1可诱发大鼠痛觉敏化; 2、NRG1/ErbB2通过活化脊髓胶质细胞促进大鼠骨癌痛的痛觉敏化; 3、NRG1通过ErbB2受体促进AKT-1、P38MAPK的磷酸化，并最终引起下游炎症介质IL-1β的释放增加，从而导致痛觉敏化。 4、NRG1-ErbB2受体信号通路在骨癌痛的产生和维持中发挥着重要的作用。