肺癌是人类健康的主要“杀手”,也是我国男性和女性最主要致死性癌症之一,包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(发病率约占80%)。肺腺癌属于非小细胞肺癌(NSCLC),是最常见肺癌之一,发病率约占原发性肺癌的20-30%,在许多国家已超过鳞状细胞癌。目前,临床采用外科治疗、放射治疗、化学治疗等多种方法综合治疗NSCLC。近年来,NSCLC的治疗虽获得较为快速的进展,但NSCLC的预后及治疗仍不理想,包括肺腺癌在内的各类肺癌总体的5年生存率仍非常低(15%以内)。因此,发现新的高效低毒的治疗药物,对延长病人的生存期及降低肺腺癌等肺癌的死亡率有着重要意义。生物芯片是21世纪生命科学领域的一项重要的技术平台,具有高通量和快速测量等优点。由于,表达谱芯片在研究细胞基因表达模式上具有的优势,利用它可获取肿瘤细胞生长的各期以及肿瘤发生与发展过程中相关基因的表达模式变化,因此,基因表达谱芯片已广泛应用于肿瘤发生机制、早期诊断、肿瘤基因分型、指导治疗及评估预后等研究领域。随着,表达谱芯片技术的广泛开展,产生了丰富的、海量的、复杂的生物信息数据。如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息,揭示其中蕴含的生命特征和规律,已成为限制基因芯片技术应用和发展的主要“瓶颈”。生物信息学是一门新兴的学科,它综合运用数学、计算机科学和生物学等多学科知识和工具,阐明和揭示大量数据所包含的生物学意义。生物信息学的出现为解读生物芯片数据提供一种新的思路和方法,解决了基因芯片技术应用的“瓶颈”问题,同时,生物信息学也为药物发现提供新方法,它已融入现代药物的研制过程,对加速药物发现有着重要意义。人类药物发现经历了从自然界随机筛选发现药物,到以机制为基础和以靶结构为基础的新药发现过程,该过程也是一个盲目发现药物到理性设计和发现新药的历程。基因芯片和生物信息学的出现,变革了药物发现模式,当前药物的发现和开发进入一个新的历史阶段,即以基因为基础的药物发现和开发时期。近年来,基因表达谱在药物研究方面的应用越来越广泛,许多学者构建一些与活性化合物或药物相关的基因表达谱数据库,其中,Lamb等构建的"connectivity map"数据库影响最大。"connectivity map"建立“基因-疾病-药物”之间的联系图,为药物发现及研究提供新思路,形成一种独特的药物发现新模式：即基于化合物或药物基因表达谱的药物发现模式,通过该方法可筛选到一些疾病治疗候选化合物,加速了药物发现过程,特别是对于那些临床低发或罕见疾病的治疗药物发现有着更为重要意义。目前,许多学者已成功应用"connectivity map"进行药物筛选和药物发现。综上,由于肺腺癌属于最常见的肺癌类型,严重威胁人类健康,因此,寻找一些高效、低毒的肺腺癌治疗药物有着迫切的临床需要。本研究将利用基于基因表达谱的药物发现模式,通过计算生物学和系统生物学分析策略"connectivity map"筛选肺腺癌治疗候选化合物或药物,并进行相关的实验验证。本研究将为肺腺癌的治疗药物发现和临床治疗提供理论及实验依据,同时也加速肺腺癌药物发现过程。本研究内容主要分为三个部分：第一部分基于基因表达谱的肺腺癌治疗药物筛选目的：探讨基于基因表达谱的药物发现途径在肺腺癌治疗药物筛选中的应用价值,筛选和发现新的肺腺癌治疗药物。方法与结果：1.从GEO中获取肺腺癌基因表达谱数据集：通过Ftp工具,从NCBI的GEO数据库中获得两个肺腺癌基因表达谱数据集,即GSE7670和GSE10072,其中,GSE7670数据集来源于台湾台北荣民总医院,共64个样本；GSE10072来源于美国N.I.H遗传流行病学部,共107个样本,两数据集均采用GPL96芯片平台。为提高生物信息学分析的质量,我们首先采用RMAexpress软件对芯片样本进行了质量分析,删除偏差大的样本数据。最后,从GSE7670获得36个样本,包括16个肺腺癌样本和20个癌旁正常样本；从GSE10072中获得43个样本,包括20肺腺癌样本和23个癌旁正常样本。2.肺腺癌差异表达基因分析为了获得肺腺癌共同差异基因表达谱,我们采用BRB软件分别对GSE10072和GSE7670数据集进行基因差异表达分析,最终通过Venny作图工具获得共同差异表达基因344个,其中上调基因93个,下调基因251个(Fold change>2)。3.Cmap筛选肺腺癌治疗药物首先,我们建立肺腺癌gene query signature文件,然后通过cMAP在线分析工具进行肺腺癌候选药物筛选,结果表明,热休克90抑制剂(tanespimycin,monorden,alvespimycin,geldanamycin)、HDAC抑制剂(trichostatin A, vorinostat)、PPAR受体激动剂(15-delta prostaglandin J2, troglitazone,pioglitazone,bufexamac)与PI3K抑制剂(LY-294002)等4类药物负性富集分数较高,可较好的逆转肺腺癌基因表达谱,提示这些药物可能成为肺腺癌治疗候选药物。结论：基于基因表达谱的药物发现途径应用于肺腺癌治疗候选药物发现是可行的。通过本研究筛选到一些肺腺癌候选治疗药物,为下一步实验研究提供理想的候选药物或化合物,加速了药物发现过程。第二部分17-AAG对肺腺癌A549细胞的增殖抑制作用目的：在第一部分,我们筛选到多类肺腺癌治疗候选化合物,特别是多种Hsp90抑制剂(如tanespimycin(17-AAG),monorden,alvespimycin及geldanamycin等)被筛选到,其中17-AAG负性富集分数最高,它是格尔德霉素衍生物,目前正在进行临床Ⅰ／Ⅱ期试验。本部分主要观察17-AAG对肺腺癌A549细胞的增殖抑制作用,并观察17-AAG对A549细胞周期和细胞凋亡的影响。方法与结果：1.17-AAG对肺腺癌A549细胞的增殖抑制作用：采用MTT法测定17-AAG对A549的增殖抑制作用,实验分不同浓度17-AAG组(0.2、0.4、0.8、1.6及3.2μM)、阴性对照组及空白对照组,药物处理时间为24h、36 h、48h。结果显示：不同的剂量组对A549细胞的生长抑制作用有统计学差异(F=586.02,P=0.000)；同一剂量3个不同时间点有统计学差异(F=116.262,P=0.000)；剂量与时间占之间有交互效应(F=18.789,P=0.000)。17-AAG作用24h、36h及48h时,其半数抑制浓度(IC50)分别为1.539、0.884和0.455μM,提示17-AAG对A549细胞的生长抑制呈现一定的时间依赖性。2.17-AAG对A549细胞的细胞周期阻滞作用：通过流式细胞技术分析各种浓度17-AAG作用A549 24h后细胞周期的变化,结果表明：0.11μM、0.23μM及0.45μM剂量组G2／M期细胞比例分别为(12.93±0.29)%、(20.57±0.29)%和(23.00±3.64)%,与对照组(6.03±0.95%)相比有统计学差异(P<0.001),但0.23μM和0.45μM两剂量组之间无明显差异(P>0.05)。3.17-AAG对A549细胞凋亡诱导作用不同剂量17-AAG作用A549 24h后,通过Annexin-V和PI双染法检测A549细胞凋亡的变化。结果表明,17-AAG可诱导A549发生凋亡,其凋亡诱导效应与剂量有关。与阴性对照相比,0.11μM17-AAG组早期凋亡率无统计学意义(P>0.05)；0.23μM 17-AAG组晚期凋亡率(11.86±0.951%)高于对照组,有统计学差异(P<0.05),但早期凋亡率无统计学差异(P>0.05)；0.45μM 17-AAG组早期凋亡率(9.35±0.547%)和晚期凋亡率(21.316±1.036%)均高于对照组,有统计学差异(P<0.005)。与低、中剂量组相比,0.45μM 17-AAG组早期和晚期凋亡率均明显增加,有统计学差异(P<0.005)。结论：17-AAG抑制A549细胞增殖,引起A549细胞在G2／M期产生阻滞,并诱导A549细胞凋亡.第三部分17-AAG协同顺铂抑制肺腺癌细胞的增殖目的：顺铂是治疗非小细胞肺癌最为常用的基础化疗药物,但单用具有副作用多、毒性大及产生耐药性等缺点,故寻找高效低毒的顺铂增敏剂有重要临床意义。我们的研究表明,17-AAG可有效的抑制肺腺癌A549细胞增殖,导致细胞周期G2／M阻滞,并诱导肺腺癌细胞凋亡,本部分将探讨17-AAG与顺铂的联用是否产生协同效应,为17-AAG治疗肺腺癌提供实验依据。方法与结果：1.MTT法检测17-AAG联合顺铂对A549细胞的增殖抑制作用。实验分：对照组、各种剂量顺铂组(4.4,8.7,17.5,35及70μM)、不同剂量17-AAG组(0.025,0.05,0.1,0.2及0.4gM)和上述各浓度两药物联合组(17-AAG+顺铂组),A549细胞分别与各种药物孵育48h。应用中效原理对17-AAG和顺铂联合用药作用进行评价,发现17-AAG和顺铂联合可产生良好协同抑制效应,合用时中效浓度及各自所需用量均比单用时要小：顺铂单用时Dm为69.627μM,合用时Dm为16.19gM,合用时比单用时小4.3倍：而17-AAG单用时Dm为0.4547μM,合用时Dm为0.093gM,合用时比单用时小4.89倍。按中效原理,我们得出17-AAG与顺铂两药合用的效应与合用指数关系,随着两药剂量的增加,其效应fa和CI也相应增加,当效应fa>0.8时,两药合用指数CI>1,产生拮抗效应；fa<0.8时,CI<1,两药合用产生协同作用,即17-AAG<1.24μmol／L与顺铂<217μmol／L的剂量联合用药时,可产生协同作用。2.17-AAG与顺铂联合应用对细胞周期影响A549细胞分别经各剂量17-AAG(0.12μM,0,23μM或0.45μM)+701μM ciplatin处理24h之后,采用流式细胞技术分析17-AAG与顺铂联合应用之后细胞周期变化。结果表明：当17-AAG与顺铂联合作用后,与对照组相比较,细胞周期G1期和G2／M期细胞比率无统计学差异(P>0.05),仅在0.45μmol／L 17-AAG与70μmol／的顺铂联用时,发现S期细胞比率增加,有统计学差异(P<0.05)。3.17-AAG与顺铂联合应用对细胞凋亡影响A549细胞经17-AAG或顺铂或17-AAG+顺铂处理24h之后,通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化。结果表明：各药物组之间早期凋亡率(F=97.60,P=0.000)和晚期凋亡率(F=645.01,P=0.000)有统计学差异。与顺铂单剂量用药相比,低剂量(0.12μM)17-AAG与顺铂合用其早及晚期凋亡率无统计学差异(P>0.05),但17-AAG在较大剂量下与顺铂联用后,早及晚期凋亡率有统计学差异(P<0.005),尤其是坏死细胞和晚期凋亡率统计学差异显著(P<0.001)。结论：17-AAG与顺铂联合可产生协同抑制A549细胞增殖的作用,并增强顺铂诱导A549细胞凋亡.