论文部分内容阅读
研究背景房颤(AF)的触发(focal trigger)、驱动(focal driver)和维持机制目前仍不是很清楚,在触发、驱动机制方面,有许多研究报道,发现心脏腔静脉系统如冠状静脉、上下腔静脉、肺静脉系统等部位的灶性放电触发阵发性房颤。基础研究表明:心脏腔静脉系统存在心房肌细胞延伸的心肌肌袖,进一步研究表明肺静脉肌袖在胚胎起源上有别于心房肌,而与起源静脉窦的窦房结、房室结、希氏束等传导系统存在共性。研究还发现,在肺静脉心肌层中有与窦房结的结样细胞(node-iike cells)非常相似的超微结构的细胞,从而提示肺静脉内的结样细胞有潜在的起搏功能。因此,肺静脉肌袖中具有潜在的起搏功能细胞及与心房组织在胚胎起源的不同使二者的电生理特性存在差异,从而在房颤的发生中具有重要作用。此外心房肌迷走神经张力异常也可能和触发机制有关,迷走神经干、心脏脂肪垫和心脏内血管神经丛可能使自律细胞膜电位减小、自律性增高,后除极与触发活动诱发房性早搏、短阵房性心动过速和房颤。在维持机制方面,近年来,由于对房颤研究的不断深入,心房重构(atrial remodeling)越来越受到重视。心房重构包括心房电重构(AER)和心房的结构重构(AAR)。AER是指心房有效不应期(AERP)缩短,动作电位时程(APD)缩短和传导速度(CV)减慢等电生理特性的变化,这些变化和离子流及离子通道重构有关。而AAR是指心房组织、细胞在大体结构和超微结构以及分子水平发生的变化,同时伴有心房收缩功能的变化即心房收缩功能重构(contractile remodeling)。房颤发生后在数秒至数分钟内即出现离子的浓度、离子通道的活性和磷酸化改变,数小时至数天即出现离子通道的信使核糖核酸(mRNA)表达和蛋白表达改变,包括缝隙连接蛋白(Cx)的改变。随后出现心房肌细胞肥大、凋亡、炎性细胞浸润、间质纤维化。心房电重构、结构重构、腔静脉系统肌袖和心房肌细胞延伸的空间分布不均一性,以及肌袖和心房肌之间电传导通道缝隙连接的异质性,是房颤发生的维持基质。心律失常和单个细胞的电活动有关,但更多地依赖于细胞间电活动的被动传导,即细胞间缝隙连接(Gap Junction GJ),因为心肌是由分离的心肌细胞组成,每个细胞被绝缘的脂质双分子层包绕,心脏的心电活动需要细胞间的缝隙连接的电耦联使电传导迅速传递。目前有关心律失常的细胞电生理解释大多是构建于单细胞膜蛋白离子通道基础之上的,因而目前的抗心律失常药物常常没有多少作用,因为目前的抗心律失常药物主要是作用于离子通道,而不是针对心律失常(包括房颤)的触发、驱动机制及折返基质。实际上心律失常(包括房颤)是整个心脏所有心房和、或心室肌细胞协同参与完成的不规整搏动,因此近年来学者们普遍认识到,心律失常更多地依赖于细胞间电激动的被动传导(即被动电生理活动),并且证实承载细胞间电激动传导的结构基础是细胞间缝隙连接(GJ)。缝隙连接(GJ)由缝隙连接蛋白构成,GJ作为细胞间的一种特殊通道介导着细胞间电和化学信号的传递,在维持电和机械耦联的正常进行以确保心肌协调收缩方面起着重要作用。组成缝隙连接的蛋白简称连接蛋白(Cx),在人体心肌,主要有Cx31.9、Cx37、Cx40、Cx43和Cx45五种连接蛋白,其中Cx43在四个心腔均分布丰富,Cx45主要分布在心肌传导束及蒲氏纤维,Cx40主要分布在心房肌。心肌细胞彼此在三维空间上按照端-端连接、侧-侧连接及二者之间的多种过渡方式进行电耦联和细胞间通讯,最大程度的连接发生在细胞的端端连接。当Cx量的改变、磷酸化状态及分布异常导致缝隙连接的构成、面积、密度、特性、空间分布发生变化即缝隙连接重构,心房肌的传导速度和传导的各向异性发生改变,从而导致微折返的形成,房颤因而容易产生和维持。Cx40是心房电激动传导的关键蛋白,因而在房性心律失常(房颤)的研究中被寄予厚望。虽然对缝隙连接蛋白Cx40、Cx43变化在风湿性心脏病房颤的发生中的作用有较多的研究报道,但缝隙连接蛋白Cx40、Cx43在冠心病左、右心房肌中的表达、分布,与房颤及左心房大小的关系如何还未见报道。本研究采用冠心病患者左右心耳标本,应用RT-PCR方法测定Cx40mRNA、Cx43mRNA表达;采用WB方法测定Cx40、Cx43表达;制备光镜标本,应用免疫荧光技术,在激光共聚焦显微镜下观察缝隙连接蛋白Cx40在左右心耳肌中横切面和纵切面上的分布情况,在光镜下印证Cx40在激光共聚焦显微镜下观察的结果并观察心房肌细胞及细胞间质的重构。根据Cx40的表达及在左右心耳肌中及在缝隙连接处侧-侧连接和端-端连接两方面的分布情况及平均缝隙连接斑片的大小和密度变化分析Cx40蛋白在房颤发生中的作用。本研究分为以下三部分:第一部分冠心病患者心房肌Cx40mRNA、Cx40表达的变化及在心房颤动发生中的作用目的:观察冠心病患者窦性心律正常左房大小(SR)、窦性心律左房扩大(SR+AD)及心房颤动并左房扩大者(AF+AD)左、右心房肌细胞缝隙连接蛋白(Cx40mRNA、Cx40)的表达变化、探讨Cx40mRNA、Cx40在左、右心耳肌中的表达、与左心房大小的关系和在冠心病房颤发生中的作用。方法:选择26例接受冠状动脉旁路移植术的冠心病患者为研究对象,26例患者术前均接受冠状动脉造影检查,根据心电图和心脏彩超资料分为三组:AF+AD组6例,SR+AD组8例,SR组12例,分别于手术中切取左、右心耳标本(心房大小正常者一般只切取右心耳肌标本)。用RT-PCR方法及免疫印迹法(Western blot)检测Cx40mRNA、Cx40的表达。结果:1.Cx40mRNA、Cx40表达量均值在三组患者的右心房肌标本中无显著差异(P＞0.05)。2.Cx40mRNA、Cx40表达量均值在SR+AD、AF+AD组左心耳肌标本中比较无显著性差异(P＞0.05)。3.Cx40mRNA、Cx40表达量均值在SR+AD、AF+AD组左心耳肌标本中与三组患者的右心耳肌标本比较明显降低,有显著性差异(P＜0.01)。结论:1.左心房扩大后左心房肌Cx40mRNA、Cx40表达下调。2.左心房扩大并房颤后Cx40mRNA、Cx40表达无进一步下调。3.左心房扩大和左房Cx40表达下调可能是房颤的产生和维持的重要因素。第二部分冠心病患者心房肌Cx43mRNA和Cx43表达的变化及在房颤中的作用目的:观察冠心病患者窦性心律正常左房大小(SR)、窦性心律左房扩大(SR+AD)及心房颤动并左房扩大者(AF+AD)左、右心房肌细胞Cx43mRNA和Cx43表达的变化、探讨冠心病患者Cx43mRNA和Cx43表达的变化及在房颤中的作用。方法:选择26例接受冠状动脉旁路移植术的冠心病患者为研究对象,26例患者术前均接受冠状动脉造影检查,根据心电图和心脏彩超资料分为三组:AF+AD组6例,SR+AD组8例,SR组12例,分别于手术中切取左、右心耳标本(心房大小正常者一般只切取右心耳肌标本)。用RT-PCR法检测Cx43mRNA表达,用免疫印迹法(Western blot)检测Cx43蛋白的表达。结果:Cx43mRNA和Cx43表达量均值在三组患者的左、右心房肌标本中采用方差分析及两-两比较均无显著差异(P＞0.05)。结论:1.冠心病患者不论是否发生左房扩大和房颤,左右心房肌细胞中Cx43mRNA表达无明显变化。2.冠心病患者不论是否发生左房扩大和房颤,左右心房肌细胞中Cx43表达无明显变化,3.冠心病患者左房扩大和房颤对Cx43mRNA和Cx43的表达均无明显影响,说明Cx43mRNA和Cx43表达的变化对冠心病房颤的发生影响较少。第三部分Cx40在冠心病患者左右心房肌中的重构及在房颤中的作用目的:应用免疫组化技术对Cx40进行定位、定性、定量,采用激光共聚焦显微镜观察Cx40在冠心病患者窦性心律正常左房大小(SR)、窦性心律左房扩大(SR+AD)及心房颤动并左房扩大者(AF+AD)左、右心房肌细胞侧-侧和端-端缝隙连接处的分布,与左心房大小的关系,探讨Cx40在左右心房肌细胞中的分布变化及其在冠心病房颤发生中的作用。光镜下观察心房肌细胞及细胞间质的结构变化,Cx40在冠心病患者SR组、SR+AD组及AF+AD组左、右心房肌细胞侧-侧和端-端缝隙连接处的分布数,与左心房大小的关系,探讨心房肌细胞、细胞间质及Cx40重构的变化及在冠心病房颤发生中的作用。方法:选择26例接受冠状动脉旁路移植术的冠心病患者力研究对象,26例患者术前均接受冠状动脉造影检查,根据心电图和心脏彩超资料分为三组:AF+AD组6例,SR+AD组8例,SR组12例,分别于手术中切取左、右心耳标本(心房大小正常者一般只切取右心耳肌标本)。用激光共聚焦显微镜和光镜观察缝隙连接蛋白Cx40在左右心耳肌横切面和纵切面上的分布及其在侧-侧连接处及端-端连接处的大小和密度变化;结果:1.Cx40在三组患者右心房肌端-端连接处及侧-侧连接处的大小变化无显著差异(P＞0.05)。2.SR+AD、AF+AD组左心房肌Cx40在端-端连接处及侧-侧连接处的大小与SR左心房组和三组右心房肌比较明显增加(P＜0.01)。3.Cx40在端-端连接处及侧-侧连接处的大小变化均值在SR+AD、AF+AD组左心房肌中比较无显著性差异(P＞0.05)。4.左心房扩大后不论是否出现房颤,心房肌细胞、细胞间的基质及Cx40发生了重构。缝隙连接蛋白40呈明显的异质性分布,缝隙连接处平均荧光斑面积增大,中心及周边密度减小,侧-侧缝隙连接和端-端缝隙连接均发生了重新分布,且有“融合”现象。结论:1.左心房扩大后,心房肌细胞、细胞间基质发生了重构2.左心房扩大影响Cx40在冠心病患者左心房肌细胞间缝隙连接处侧-侧连接和端-端连接的空间分布、数目及平均缝隙连接斑片的大小和密度。3.Cx40在冠心病患者左心房肌中的重构和左心房扩大是导致冠心病房颤的发生和维持的重要因素。