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土地盐渍化是植物生长的主要环境限制因子,研究植物耐盐机理,运用基因工程手段提高植物耐盐性是治理和利用大面积盐渍化土地经济有效的途径。盐胁迫条件下,植物通过膜系统表面的离子转运蛋白协同作用完成过量盐离子的外排及胞内区隔化,进而重建和维持植物在盐胁迫下的Na~+-K~+离子稳态平衡。然而,目前关于植物离子转运体系的研究大多集中在模式植物和作物中,对野生泌盐盐生植物的研究鲜有报道。长叶红砂作为古老且分布狭窄的珍稀泌盐植物,对盐渍化荒漠环境具有极强的适应性。本研究基于长叶红砂盐胁迫前后的转录组数据,筛选并克隆了长叶红砂4个不同类型的离子转运蛋白基因(液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白RtNHX1基因、液泡膜H~+焦磷酸化酶RtVP1基因、高亲和K~+转运蛋白Rt HKT1基因和外向整流型K~+通道蛋白Rt KCO1基因),并对其编码的蛋白质的分子特征、表达特性以及功能进行了分析,探讨在盐胁迫条件下,植物如何通过离子转运蛋白的协同作用重建体内离子稳态平衡和改善植物的耐盐性。具体研究结果如下:1.长叶红砂液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白RtNHX1基因包含有1662 bp的ORF,其编码553个氨基酸,定位于液泡膜上,能够被NaCl和外源ABA诱导表达。该基因能够恢复盐敏感AXT3酵母突变体的生长表型,同时能够将酵母细胞质中过量的Na~+和K~+区隔化入液泡,保持酵母细胞较低的Na~+/K~+比。RtNHX1基因同样可以恢复拟南芥nhx1突变体的盐敏感生长表型,盐胁迫下过表达RtNHX1基因拟南芥相比于WT植株具有更旺盛的生长,更低的叶片Na~+/K~+比,更高的抗氧化酶活性和更多的脯氨酸含量积累,证实该基因能够通过维持植物Na~+-K~+离子稳态平衡,提高抗氧化调节和渗透调节能力,进而改善植物的盐耐受性。2.采用同源克隆技术,分离了长叶红砂液泡膜H~+焦磷酸化酶RtVP1基因,该基因包含有2292 bp的ORF,编码763个氨基酸,定位于细胞膜和液泡膜上,同时可以被NaCl和外源ABA诱导表达。Rt VP1基因能够恢复拟南芥avp1突变体的缺糖敏感表型。过表达RtVP1基因能够提高拟南芥体内的葡萄糖、蔗糖和可溶性糖含量,改善了植物的各种生长指标,证实该基因可通过加速植物的多糖代谢,促进植物的营养生长,另外,盐胁迫下过表达RtVP1基因酵母细胞和拟南芥叶片的Na~+/K~+比均显著降低,证实该基因在维持Na~+-K~+离子稳态平衡中发挥重要作用;同时转基因拟南芥的抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性多糖含量显著升高,证实该基因通过参与调控活性氧清除和渗透调节机制,进而提高植物对高盐胁迫的耐受性。3.转Rt HKT1基因酵母对高Na~+和低K~+耐受,且保持着相对较低的Na~+/K~+比;转RtHKT1基因拟南芥对高Na~+耐受、对高K~+或对高Na~+低K~+敏感,表明转基因拟南芥的Na~+耐受性依赖于外部适量浓度的K~+。转基因酵母分别在外部高Na~+、高K~+、低K~+环境下积累更多的Na~+-K~+、Na~+、K~+;而转基因拟南芥在外部高Na~+、高K~+、低K~+环境下分别积累更多的K~+和更少的Na~+、更多的Na~+、更多的Na~+-K~+,这些结果证实Rt HKT1的离子转运特性依赖于外部Na~+和K~+离子环境。盐胁迫诱导了一些离子转运蛋白基因上调表达,同时也有些被下调表达,暗示多离子转运体协同作用维持植物在盐胁迫下的Na~+和K~+离子稳态平衡。在盐胁迫下,过表达Rt HKT1基因拟南芥生物量和叶绿素含量显著升高,抗氧化酶活性和脯氨酸含量显著升高,表明该基因能够改善转基因植物的耐盐性,主要通过重建和维持植物体内的Na~+-K~+稳态平衡、提高抗氧化调节和渗透调节能力。4.转RtKCO1基因酵母对高Na~+和高K~+耐受,而转RtKCO1基因拟南芥对高Na~+和低K~+耐受,表明Rt KCO1基因可能在酵母和拟南芥中发挥不同的功能。转基因酵母在外部高Na~+和高K~+环境下分别积累更多的Na~+-K~+和K~+;而转基因拟南芥在外部高Na~+和低K~+环境下分别积累更少的Na~+-K~+和更多的K~+,尽管离子分布模式不同,但它们均保持相对较低Na~+/K~+比,这些结果表明Rt KCO1基因在酵母和拟南芥中的离子转运特性依赖于外部的Na~+和K~+环境,同时该基因通过保持相对稳定的Na~+/K~+比,使得酵母和植物能快速的适应外界环境。另外,盐胁迫下的转基因拟南芥具有较高的生物量、抗氧化酶活性和脯氨酸含量,表明该基因能够改善植物的抗氧化调节和渗透调节能力,进而提高植物的耐盐性。5.基于上述研究结果,构建了离子简易离子转运模型:长叶红砂液泡膜RtNHX1蛋白能够将Na~+和K~+区隔化入液泡,同时将H~+泵出液泡;而液泡膜RtVP1能够将质子跨膜泵入液泡建立质子电化学势,为RtNHX1提供质子驱动力;质膜RtHKT1蛋白介导K~+离子跨质膜的转运,阻止过多的Na~+离子转运到地上部分的叶细胞;质膜RtKCO1通道蛋白,促进细胞质中的Na~+离子和K~+离子外排。这些离子转运蛋白相互协同,共同重建和维持植物在盐胁迫下的Na~+-K~+离子稳态平衡,同时提高植物的渗透调节和抗氧化调节能力,进而改善植物对盐胁迫的耐受性。