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乙型肝炎病毒（HBV）严重威胁着人类的健康，采用合适的模型和可靠的检测手段来筛选新型的抗HBV药物一直是人们研究的热点。本文中，我们建立一套荧光定量PCR检测HBV共价闭合DNA（cccDNA）的方法；对两个HBV的稳定表达细胞模型进行了动态分析；并结合ELISA，利用HepG2-N10细胞和所建立的HBV cccDNA荧光定量体系，体外研究了绿茶提取物（GTE）和原核表达的重组苦瓜蛋白的抗乙肝病毒作用。第一章：文献综述。概括介绍了乙型肝炎病毒、乙型肝炎的发病机理和治疗、HBV cccDNA检测的意义、药物筛选模型及绿茶提取物等植物抗病毒因子的生物学活性等。并在本章最后介绍了本论文的研究目的、内容和意义。第二章：实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA方法的建立。采用一对跨越HBV基因组正负两链的两个缺口的特异性引物，利用基于Eva greenTM荧光染料的荧光定量PCR技术，用构建的含有HBV基因组的质粒为定量标准品，分别对乙型肝炎患者及健康者的血清、HBV稳定表达细胞系进行检测。结果显示，该系统灵敏度高，重复性好。对血清样本的检测结果显示：六例大三阳患者的血清中有五例检测到了cccDNA，而其他小三阳等样本中没有检测到cccDNA，在HepG2 2．2．15和HepG2-N10细胞核中也检测到cccDNA的存在。第三章：两种稳定表达乙型肝炎病毒的细胞系的动态分析。利用ELISA和Real-time PCR，分别从细胞的增殖、病毒的抗原表达、胞外HBV DNA的合成、细胞内HBV复制型中间体及细胞核内HBV cccDNA水平等方面对两种乙型肝炎病毒的稳定表达细胞系HepG2 2．2．15和HepG2-N10进行了动态分析，结果显示，HepG2-N10具有较快的生长速度，而且能分泌较多的乙肝表面抗原（hepatitis B s Antigen，HBsAg）、乙肝e抗原（Hepatitis B e Antigen，HBeAg）和Dane颗粒；而HepG2 2．2．15的细胞内复制型中间体的量要明显高于HepG2-N10，而且细胞核内的cccDNA的载量比HepG2-N10多一倍。抗病毒试验显示，HepG2-N10能够更快速地验证抗病毒药物的抑制作用，3TC作用六天即可显示出明显的抗乙肝病毒效果。因此，HepG2-N10是一个生长速度较快、易于培养的乙肝病毒表达细胞系，能用于研究HBV生物学特性、乙肝的发病机制、体外抗HBV药物筛选等多项研究。第四章：绿茶提取物（GTE）体外抗乙型肝炎病毒研究。利用HepG2-N10，ELISA测定GTE及其主要成份表没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）作用前后HBeAg和HBsAg的变化。结果显示：GTE在最小有效剂量10μg／ml时即可有效抑制HBV的产生。HBsAg和HBeAg的抑制与GTE作用成剂量依赖关系，并随药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用也随着增强，差异显著（P＜0.01）；EGCG单独作用于HepG2-N10时，对乙型肝炎病毒也有很强的抑制作用，但与GTE相比作用较弱。用Real-time PCR分析了药物作用前后HepG2-N10细胞培养基上清HBV DNA、细胞内复制性中间体，以及细胞核内的cccDNA的影响；采用One-step reverse transcriptase PCR分析了GTE对于HBV的转录的抑制作用。结果预示以GTE有望成为治疗乙型肝炎的另一种替代或辅助治疗药物。第五章：重组苦瓜抗病毒蛋白MAP30的克隆表达与生物学活性研究。分别采用PCR和RT-PCR扩增出编码MAP30蛋白的基因和cDNA，经测序鉴定后将MAP30 cDNA克隆到原核表达载体pET-28a实现高效表达，结果表明该融合蛋白主要以可溶的形式存在。活性验证表明重组蛋白MAP30具有抗金黄色葡萄球菌生长和抑制真菌菌丝延伸作用，而且对于人正常肝细胞株L-02没有毒性，而作用于癌细胞时，细胞毒性随浓度的增加而增加，二者成剂量依赖性关系，ID50为0.0283mg／ml。将纯化的重组MAP30作用于HBV稳定转染细胞系HepG2-N10，并测定HBV的抗原表达变化，结果表明，重组MAP30具有抗乙型肝炎病毒作用，在所试验的最高浓度0.04mg／ml时，对HBsAg的抑制率最高为12.9％，对HBeAg的最高抑制率为26.7％。