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[目的]基于前期课题组测量的不同性别、年龄以及骨状态的股骨头松质骨骨表面微观形貌参数为指导,以静电纺丝法制备聚乳酸(Polylactic Acid,PLA)复合纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)纤维膜,旨在模拟不同骨表面微观形貌参数,研究大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)在该表面上的增殖、铺展形态以及成骨分化的影响,从而明确骨表面微观形貌参数与细胞成骨分化的相关关系,寻找利于rBMSCs成骨分化的材料微观形貌参数,并为今后材料界面改性及表面修饰提供参数指导。[方法]1、纳米羟基磷灰石/聚乳酸纤维膜的制备、表征、参数测量将聚乳酸、纳米羟基磷灰石、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)、二氯甲烷以不同比例混合均匀,通过调整电纺丝参数:正负极电压、接受距离、接收时间、推注速度,制备不同直径参数的nHA/PLA纤维膜。利用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)对干燥后的纤维膜样品进行图像表征,并随机选取20根纤维进行直径测量;X射线光电子能谱分析纤维膜表面元素组成;水接触角测量材料的亲水性。2、纳米羟基磷灰石/聚乳酸纤维膜的筛选通过调整电纺丝参数:电压16-24kv,接受距离12-18cm,推注速度0.2mm/min和0.3mm/min,接受时间1-2h,制作具有不同纤维直径参数的nHA/聚乳酸纤维膜,筛选纤维直径区间在100nm-1300nm中的纤维膜,分别选取相对直径值为:粗直径:A1 组(900-1300nm)、中直径:A2 组(500-900nm)、细直径:A3组(100-500nm)作为形貌组进行研究;分组具体参数为A1组:纤维直径1153±151nm,A2 组:纤维直径 652±127nm,A3 组:纤维直径 271±116nm。3、不同纤维直径nHA/PLA纤维膜上rBMSCs增殖、形态与成骨分化检测在形貌组nHA/PLA纳米纤维膜上培养适宜的P5-P7代rBMSCs,分别在A1组(纤维直径1153±151nm),A2组(纤维直径652±127nm),A3组(纤维直径271±116nm)以及Ctrl组(空白对照培养板组),SEM观察rBMSCs在不同纤维直径参数下纤维膜上的生长、铺展以及形态,CCK-8试剂盒检测rBMSCs的增殖情况,qRT-PCR检测碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨 钙 蛋 白(osteocalcin,OCN)、以 及Runx2(runt-related transcription factor 2)mRNA 的表达,观察纤维膜的生物相容性以及不同直径参数纤维膜对rBMSCs成骨分化的影响。[结果]1、股骨头松质骨骨表面微观形貌参数选取结果通过课题组前期建立的对股骨头松质骨骨表面微观形貌的表征与参数提取分析方法,扩大样本量对24例股骨头样本进行测量,对骨质疏松病人股骨头进行分区分为:正常区,骨质减少区,骨质疏松区并进行测量分析,测得正常区中年男性/女性矿化胶原束直径在600-900nm区间,而骨质减少区,骨质疏松区平均纤维直径在1200nm左右,纤维直径变化从正常区,骨质减少区,骨质疏松区呈逐渐增大趋势;而我们前期研究的纤维直径为通过查阅文献获得的细胞外基质胶原纤维直径参数,直径为100-500nm,为了具体比较三者,我们选取100-500nm、500-900nm、900-1300nm纤维直径参数作为比较研究对象。2、静电纺丝制备nHA/PLA纤维膜与纤维膜筛选通过调整静电纺丝电压(16kv-24kv);接收距离(12cm-18cm);接收时间(1h-2h);推注速度(0.2mm/min-0.3mm/min)获得了纤维直径在 10Onm-1300nm区间内的不同纤维形貌的聚乳酸/纳米羟基磷灰石纤维膜。从中筛选出以下电纺参数中可纺性较佳且纤维均匀,直径呈梯度分布的随机纤维形貌的纤维膜:A1 组:直径 11 53±151nm(电纺丝参数·:15cm,24kv,1h,0.2mm/min);A2 组:直径 652±127nm(电纺丝参数:12cm,24kv,2h,0.3mm/min);A3 组:直径 271±116nm(电纺丝参数:15cm,24kv,2h,0.3mm/min)。3、SEM电镜下观察细胞在纤维膜的铺展情况、CCK-8观察细胞在纤维膜上的增殖情况,qRT-PCR检测细胞成骨分化情况SEM电镜下观察细胞在纤维膜的铺展情况显示,在A2组(652±127nm)纤维直径的nHA/PLA纤维膜上,rBMSCs面积较大,呈不规则梭型,且细胞与纤维之间黏连嵌入,结合紧密,细胞伪足更多。A3组同样显示出相似的细胞铺展形态情况,A1组细胞铺展面积大小不如A2、A3组。CCK-8增殖实验显示,第1,3,5天,普通培养板对照组、A2组(652±127nm)、A3组(271±116nm)均优于A1组(1153±151nm),差异具有统计学意义(P<0.05),三组间对比,普通培养板对照组优于A2、A3组,差异具有统计学意义(P<0.05),A2、A3组两组间对比,A2组优于A3组,差异无统计学意义(P>0.05);第7,9天,对照组优于A2、A3组,差异具有统计学意义(P<0.05),A2组优于A3组,差异具有统计学意义(P<0.05);成骨分化检测显示:A2组显示出优秀的成骨诱导能力,其中ALP、Runx2、OCN的qRT-PCR检测情况显示,其表达均优于A1、A3组。[结论]1、通过调节电纺参数为(15cm,24kv,1h,0.2mm/min)、(12cm,24kv,2h,0.3mm/min)、(15cm,24kv,2h,0.3mm/min)可制备直径分别为1153±151nm、652±127nm、271 ±116nm 的 nHA/PLA 纤维膜,制作的纤维膜为随机取向纤维,且纤维膜上附着纳米羟基磷灰石,具有更佳的生物相容性,与骨细胞外基质中胶原纤维网状结构类似。2、纤维膜直径参数变化能影响rBMSCs形态、黏附,其中A2组(直径652±127nm)的纤维膜上,细胞呈集落铺展,生长较佳,呈不规则梭型,且与纤维之间黏连嵌入,细胞伪足更多。3、相比 A1 组(直径 1153±151nm)、A3 组(直径 271±116nm),A2组(直径652±127nm)上细胞的增殖情况更佳。4、成骨分化检测显示,652±127nm纤维直径参数的纤维膜具有更佳成骨诱导能力,证明纤维膜形貌中直径参数的变化能够影响rBMSCs的成骨分化。