黑龙江猪旋毛虫43ku ES抗原基因的克隆与表达

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旋毛虫病(Trichinosis)是在世界范围内流行的人兽共患寄生虫病。旋毛虫相对分子质量43000分泌-排泄抗原(Trichinella Spiralis 43 Excretory-Secretory antigen,Ts43 ES)是旋毛虫ES抗原中主要功能性抗原之一,且与旋毛虫包囊的形成相关。根据GenBank中编码旋毛虫Ts43基因的cDNA序列(M95499),设计并合成引物,利用RT-PCR方法获得黑龙江猪旋毛虫Ts43基因后,成功克隆Ts43基因,与参考序列的同源性为99.61%,氨基酸序列同源性为99.13%;在此基础上成功地构建了旋毛虫肌幼虫ES抗原基因Ts43基因片段(不含信号肽)的原核表达载体pET32a-Ts43和真核表达载体pcDNA3.1/CT-GFP-Ts43。成功构建Ts43基因的原核表达载体pET32a-Ts43后,重组子转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导后获得高效表达,产物为55ku的融合蛋白,并以包涵体的形式存在,表达量达到菌体总蛋白的22.6%,间接ELISA分析证明纯化复性后的原核表达产物活性有所提高,但不是很理想。真核表达载体pcDNA3.1/CT-GFP-Ts43经Lipofectamine 2000脂质体转染在Vero E6(非洲绿猴肾细胞)中进行了表达,GFP标签证明真核表达载体pcDNA3.1-CT-GFP-Ts43质粒转染Vero E6细胞24h后,目的基因即在Vero E6细胞中有所表达,72h达到高峰;Western-blotting分析显示Vero E6细胞中表达的融合蛋白可被黑龙江省猪源旋毛虫阳性小鼠血清识别,目的条带位置与预测基本一致,约66ku,说明表达产物具有一定的免疫学活性。本研究发现Ts43基因结构基因保守性很高,在旋毛虫分类上具有重要意义;原核重组表达载体表达的蛋白复性后活性提高不多;真核重组表达载体pcDNA3.1-CT-GFP在Vero E6细胞中表达的融合蛋白可为旋毛虫的免疫诊断、疫苗研制和旋毛虫包囊形成机理的研究进一步提供分子生物学基础,也可成为获得天然结构的Ts43蛋白以研究其在旋毛虫包囊形成的过程中起到的作用和机理的一个途径。
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