【摘 要】
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为了探究氧阴离子洞对扩展青霉脂肪酶催化活性的影响,本论文利用同源置换手段和定点饱和突变技术对扩展青霉脂肪酶氧阴离子洞可能的构成位点进行改造,并对脂肪酶突变体的催化
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为了探究氧阴离子洞对扩展青霉脂肪酶催化活性的影响,本论文利用同源置换手段和定点饱和突变技术对扩展青霉脂肪酶氧阴离子洞可能的构成位点进行改造,并对脂肪酶突变体的催化活性进行了测定分析,主要内容包括以下两个方面:一、氧阴离子洞构成位点的同源置换和脂肪酶突变体的性质研究通过十几种同源性较高的微生物脂肪酶序列的比对,确定对131和133位点进行同源置换,共有5种置换方案。在大肠杆菌表达系统中表达脂肪酶突变体,对脂肪酶突变体进行催化活性测定,结果显示:脂肪酶突变体对三丁酸甘油酯的催化活性下降,但L 133 A/H 131 E、L 133 A两种突变对R-扁桃酸乙酯较野生型高的活性,而且表现出一定的对映体选择性。二、氧阴离子洞构成位点的定点饱和突变和突变体的性质研究对扩展青霉脂肪酶131和133位点进行定点饱和突变,构建突变文库,在大肠杆菌表达系统中表达。根据同源置换的结果,选用扁桃酸甲酯作为底物对突变文库进行筛选,最终得到6株对扁桃酸甲酯催化活性高于野生型的突变株,分别是:H 131 Y;H 131N;L133M;L133A;H131L/L133V;H 131 I/L133N。结果显示:改变氧阴离子洞的构成位点,可以明显改变脂肪酶的底物特异性。
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