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目的：本研究主要基于液质联用技术，以中药松萝和其主要的酚酸类成分作为研究对象，分别建立松萝药材定性鉴别和定量测定的质量控制，同时结合化学统计学分析方法，对不同来源的松萝药材进行质量表征同时寻找影响药材质量的主要差异成分；建立松萝药材大鼠血浆中主要酚酸类化合物的测定方法并研究其药代动力学，绘制其药-时曲线，阐明其药动学参数和特征；建立松萝中主要酚酸类成分松萝酸在大鼠体内代谢物的测定方法，鉴定和分析松萝酸的代谢物和代谢物类型，阐明松萝酸在大鼠体内的代谢途径；建立一种将传统的信息依赖采集(IDA)与新的在线非依赖采集技术(SWATH)相结合的液质方法，以更准确地识别和筛选生物标志物，并将其方法用于松萝酸干扰A549细胞的代谢组学研究，从而为全面控制松萝的质量提供解决方法，并阐明其作用机制。
方法：在电喷雾离子源(ESI)负离子模式下对松萝提取液进行质谱数据全扫描，获得质谱原始数据，色谱柱为PhenomenexKinetexC18(100mm×3.0mm，2.6μm)色谱柱，利用自建过滤模板结合多种数据后处理技术，结合已总结出的酚酸类对照品的质谱裂解规律，识别和鉴定松萝中酚酸类化学成分，然后根据鉴定出化学成分的相对峰面积，对25批不同来源的松萝中这些酚酸类成分进行半定量测定，并采用主成分分析(PCA)方法找出影响松萝质量的主要化学成分；采用电喷雾离子源(ESI)负离子条件下，多反应离子监测(MRM)对不同批次松萝药材中4种酚酸类成分进行定量，色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，并采用该方法测定了对不同批次的松萝药材，同时对不同来源的药材进行了聚类分析。大鼠灌胃给予松萝提取物后，分别于给药后在规定时间点从大鼠眼内眦静脉丛取血，并制备血浆样本，采用甲醇直接沉淀蛋白的方法进行样品预处理，色谱柱为C18柱，流动相为0.1%甲酸水-甲醇，梯度洗脱，采用ESI源，多周期正负离子同时扫描，多反应监测(MRM)模式对4个主要酚酸类化合物进行定量。大鼠灌胃给予松萝酸后收集大鼠的血浆、尿液和胆汁样本，用乙酸乙酯萃取法进行生物样本前处理，在ESI源下负离子模式下进行全扫描数据采集，同时利用多重质量亏损模板(MDF)结合动态背景扣除(DBS)的方法触发IDA扫描，然后采用多种数据后处理方法进行代谢物的筛选，获得代谢物的精确分子质量、元素组成和二级质谱图，最后基于精确质量数、相关的生物代谢转化规律和母药化合物的裂解规律，对松萝酸可能的代谢产物进行结构推测，利用ClogP值和Chem3D软件对同分异构体进行辅助区分。对松萝酸诱导的A549细胞进行UHPLC-Q/TOF-MS分析，采用LunaOmega1.6μmPolarC18(100×2.1mm)色谱柱，分别在ESI源正、负离子模式检测，首先采用IDA技术对样本进行非靶向全扫描分析，再采用SWATH技术针对初步鉴定得到的代谢物进行目标分析，通过多元统计分析筛选差异代谢物，并通过在线数据库HMDB、METLIN来鉴定差异代谢物，结合在线数据库MetaboAnalyst4.0和KEGG对差异代谢物进行通路分析。
结果：首次分析和鉴定了松萝中38个酚酸类化合物，推断和总结了松萝中不同类型酚酸类成分的质谱裂解规律，半定量分析结合PCA找出了影响药材质量的主要差异成分，表征了不同批次松萝样品之间的质量差异。定量的4种主要酚酸类成分的线性关系，仪器重复性、日内和日间精密度、稳定性、检测限和定量限均符合要求，结果表明，产地对4种酚酸类成分的含量有较大影响。大鼠灌胃松萝药材提取物后，松萝酸、扁枝衣二酸、地弗地衣酸、苔色酸在大鼠中药代动力学药-时曲线的趋势相似，且4种成分的吸收和消除均较快。松萝酸在大鼠体内代谢共鉴定的36个代谢产物，表明松萝酸在大鼠体内代谢广泛，Ⅰ相代谢反应主要为氧化和还原脱甲基化代谢，II相代谢反应主要为与葡萄糖醛酸的结合反应。采用IDA与SWATH两种在线质谱数据获取技术相结合的方法鉴定松萝酸干扰A549细胞后的内源性代谢物，共鉴定出28个差异性内源性代谢物。这些差异代谢物主要涉及苯基丙氨酸代谢代谢，鞘磷脂代谢，三羧酸循环，精氨酸和鸟氨酸代谢等。
结论：本研究首次采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS快速识别鉴定了松萝中38种酚酸类化合物，首次建立了半定量分析测定方法，结合PCA法对松萝产地质量差异进行了评价；定量结果表明该方法简便、快速、准确、灵敏度高，可用于测定松萝药材中4种主要酚酸类化合物，聚类分析结果表明不同产地的松萝药材药材质量存在一定差异。定性研究和定量分析相结合，为全面控制中药材的全面质量控制提供了解决途径和借鉴方法。药代动力学实验方法灵敏度高、选择性好、精密度好，可用于大鼠灌胃给予松萝药材提取物后，血浆中4种酚酸类化合物的药代动力学研究，该结果可为松萝的临床用药提供数据和参考。首次成功发现和鉴定了松萝酸在大鼠体内的代谢产物，为阐明松萝酸的体内过程和药理学研究奠定了基础，此外也可以为其他酚酸类化合物的体内代谢研究提供借鉴作用。本研究成功建立了非靶向代谢组学研究平台，采用IDA方法和SWATH方法相结合，分析了松萝酸干扰A549细胞后的细胞代谢组学。该研究为松萝酸的作用机制研究提供了理论依据，也为相关细胞代谢组学的研究提供了新的研究思路和技术支持。
方法：在电喷雾离子源(ESI)负离子模式下对松萝提取液进行质谱数据全扫描，获得质谱原始数据，色谱柱为PhenomenexKinetexC18(100mm×3.0mm，2.6μm)色谱柱，利用自建过滤模板结合多种数据后处理技术，结合已总结出的酚酸类对照品的质谱裂解规律，识别和鉴定松萝中酚酸类化学成分，然后根据鉴定出化学成分的相对峰面积，对25批不同来源的松萝中这些酚酸类成分进行半定量测定，并采用主成分分析(PCA)方法找出影响松萝质量的主要化学成分；采用电喷雾离子源(ESI)负离子条件下，多反应离子监测(MRM)对不同批次松萝药材中4种酚酸类成分进行定量，色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，并采用该方法测定了对不同批次的松萝药材，同时对不同来源的药材进行了聚类分析。大鼠灌胃给予松萝提取物后，分别于给药后在规定时间点从大鼠眼内眦静脉丛取血，并制备血浆样本，采用甲醇直接沉淀蛋白的方法进行样品预处理，色谱柱为C18柱，流动相为0.1%甲酸水-甲醇，梯度洗脱，采用ESI源，多周期正负离子同时扫描，多反应监测(MRM)模式对4个主要酚酸类化合物进行定量。大鼠灌胃给予松萝酸后收集大鼠的血浆、尿液和胆汁样本，用乙酸乙酯萃取法进行生物样本前处理，在ESI源下负离子模式下进行全扫描数据采集，同时利用多重质量亏损模板(MDF)结合动态背景扣除(DBS)的方法触发IDA扫描，然后采用多种数据后处理方法进行代谢物的筛选，获得代谢物的精确分子质量、元素组成和二级质谱图，最后基于精确质量数、相关的生物代谢转化规律和母药化合物的裂解规律，对松萝酸可能的代谢产物进行结构推测，利用ClogP值和Chem3D软件对同分异构体进行辅助区分。对松萝酸诱导的A549细胞进行UHPLC-Q/TOF-MS分析，采用LunaOmega1.6μmPolarC18(100×2.1mm)色谱柱，分别在ESI源正、负离子模式检测，首先采用IDA技术对样本进行非靶向全扫描分析，再采用SWATH技术针对初步鉴定得到的代谢物进行目标分析，通过多元统计分析筛选差异代谢物，并通过在线数据库HMDB、METLIN来鉴定差异代谢物，结合在线数据库MetaboAnalyst4.0和KEGG对差异代谢物进行通路分析。
结果：首次分析和鉴定了松萝中38个酚酸类化合物，推断和总结了松萝中不同类型酚酸类成分的质谱裂解规律，半定量分析结合PCA找出了影响药材质量的主要差异成分，表征了不同批次松萝样品之间的质量差异。定量的4种主要酚酸类成分的线性关系，仪器重复性、日内和日间精密度、稳定性、检测限和定量限均符合要求，结果表明，产地对4种酚酸类成分的含量有较大影响。大鼠灌胃松萝药材提取物后，松萝酸、扁枝衣二酸、地弗地衣酸、苔色酸在大鼠中药代动力学药-时曲线的趋势相似，且4种成分的吸收和消除均较快。松萝酸在大鼠体内代谢共鉴定的36个代谢产物，表明松萝酸在大鼠体内代谢广泛，Ⅰ相代谢反应主要为氧化和还原脱甲基化代谢，II相代谢反应主要为与葡萄糖醛酸的结合反应。采用IDA与SWATH两种在线质谱数据获取技术相结合的方法鉴定松萝酸干扰A549细胞后的内源性代谢物，共鉴定出28个差异性内源性代谢物。这些差异代谢物主要涉及苯基丙氨酸代谢代谢，鞘磷脂代谢，三羧酸循环，精氨酸和鸟氨酸代谢等。
结论：本研究首次采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS快速识别鉴定了松萝中38种酚酸类化合物，首次建立了半定量分析测定方法，结合PCA法对松萝产地质量差异进行了评价；定量结果表明该方法简便、快速、准确、灵敏度高，可用于测定松萝药材中4种主要酚酸类化合物，聚类分析结果表明不同产地的松萝药材药材质量存在一定差异。定性研究和定量分析相结合，为全面控制中药材的全面质量控制提供了解决途径和借鉴方法。药代动力学实验方法灵敏度高、选择性好、精密度好，可用于大鼠灌胃给予松萝药材提取物后，血浆中4种酚酸类化合物的药代动力学研究，该结果可为松萝的临床用药提供数据和参考。首次成功发现和鉴定了松萝酸在大鼠体内的代谢产物，为阐明松萝酸的体内过程和药理学研究奠定了基础，此外也可以为其他酚酸类化合物的体内代谢研究提供借鉴作用。本研究成功建立了非靶向代谢组学研究平台，采用IDA方法和SWATH方法相结合，分析了松萝酸干扰A549细胞后的细胞代谢组学。该研究为松萝酸的作用机制研究提供了理论依据，也为相关细胞代谢组学的研究提供了新的研究思路和技术支持。