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目的:随着肝脏外科技术的进步和移植免疫学的迅猛发展,肝脏移植病人和移植物的生存率明显提高,肝移植可作为终末期肝病有效的治疗方法。但是肝移植后影响移植物存活的因素很多,包括缺血再灌注损伤、排斥反应。目前由于供肝资源紧缺,如何有效保护供肝,减少移植肝脏无功能的发生率更加受到了人们的重视。HO-1蛋白是机体血红素分解代谢的限速酶,分解后产生一氧化碳(CO)、胆绿素及Fe2+,具有抗炎症、抗氧化、抗凋亡、减少血管损伤、下调血管内皮细胞细胞间黏附分子表达、增加移植器官的血流灌注等作用,已引起国内外学者的广泛关注。蛋白转导结构域(protein transduction domain , PTDs)是一小段可以直接透过细胞膜的多肽,蛋白质或多肽与PTDs相连后可进入细胞内发挥生物功能。HIV-1反式激活蛋白TAT是目前研究较多的PTDs之一。有研究证实,TAT与HO-1的融合蛋白(TAT-HO-1)可成功转导进入胰腺βTC-3细胞,并显著提高细胞活力。本研究前期实验证实TAT-HO-1蛋白可以成功转导进入离体培养的肝细胞,并且可在缺血/再灌注后、冷保存期间成功转导进入大鼠肝脏,减轻肝脏缺血/再灌注损伤、冷保存导致的细胞凋亡、炎症和氧化应激反应等。本研究在前期研究基础上,对TAT-HO-1在大鼠原位肝移植期间是否能进入肝组织细胞以及是否有效对肝脏提供抗氧化和抗炎症的保护作用这一问题进行进一步探讨。方法:把HO-1cDNA编码区与已经合成的TAT-PTD片段连接到原核表达的载体pET32a上。构建成TAT-HO-1-pET32a质粒,经测序鉴定后,转化E.coli BL-21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达、Ni-NTA-agarose(Novagen公司,德国)纯化,用Western blot法对TAT-HO-1进行定性分析,用化学法检测TAT-HO-1的活性,证实所得到的蛋白是有活性的TAT-HO-1蛋白(浓度1mg/ml)后进行动物实验。健康雄性成年SD大鼠,体重250~280g,随机分为供体组和受体组。参照Kamada等的双套管方法建立大鼠原位肝移植模型。移植完成后将受体大鼠随机分为2组(n=24)。TAT-HO-1组(P组),于移植完毕时经阴茎背静脉给予TAT-HO-1蛋白10 ml/kg。对照组(C组),于移植完毕时经阴茎背静脉给予生理盐水10 ml/kg;两组分别于分离肝脏血管及周围韧带完毕切取肝脏前即刻0h、肝脏移植术后1h、6h和12h时各随机选取6只大鼠,经腹主动脉采血3ml分离血清,并切取肝组织标本立即液氮冷冻,血清与肝组织均置于-80℃冰箱保存。使用免疫组化染色法检测肝脏组织HO-1含量,分析TAT-HO-1蛋白转导进入肝脏的情况。用Selectra-E全自动生化分析仪测定血液中谷丙转氨酶(ALT)水平。硫代巴比妥酸(TBA)法测定肝组织中MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,硝酸还原酶法测定NO含量。酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测各标本肿瘤坏死因子α表达(TNF-α)水平。采用免疫组化法检测肝组织核因子κB(NF-κB)表达水平。苏木素-伊红(HE)染色,在光镜下观察供肝组织形态学改变。结果:1免疫组化染色结果:肝移植后1h、6h、12h时两组肝实质细胞和SECs中均可见明显棕黄色HO-1阳性染色分布,蛋白组肝组织中HO-1含量高于对照组(P<0.05)。2血清中ALT、TNF-α水平测定结果:在0h时,两组血清中ALT、TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05);在1h、6h和12h,蛋白组血清液中ALT、TNF-α水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组织中SOD活性、MDA、NO含量、NF-κB表达水平测定结果:在0h时,两组肝组织中SOD活性、MDA、NO含量、NF-κB表达水平差异无统计学意义(P>0.05);1h、6h和12h,蛋白组肝组织中SOD活性明显高于对照组(P<0.05),蛋白组肝组织中MDA、NO含量、NF-κB表达水平明显低于对照组(P<0.05)。4组织病理学观察结果:在光镜下,两组在移植后的各时间点都出现了不同程度的肝血窦缩小和肝细胞索结构的损伤,肝细胞肿胀加重、炎性细胞浸润,水泡样变性明显,肝细胞多灶状坏死增多。蛋白组在6h时损伤程度明显轻于对照组。结论:TAT-HO-1融合蛋白在大鼠原位肝移植术后经静脉注射可以转导进入大鼠肝脏并减轻移植肝脏的氧化应激反应,其对肝功能的保护作用可能与HO-1抗炎症、抗氧化作用有关。