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阿维拉霉素属于正糖霉素族的寡糖类抗生素,是一种新型的消化促进剂和代谢调节剂,常作为饲料添加剂被广泛使用在禽畜养殖中。本文主要是通过分段调控优化阿维拉霉素生产菌的罐上发酵条件以提高其产量,并建立阿维拉霉素组分分离纯化的方法。同时以分离纯化得到的阿维拉霉素单组分样品为对照品,建立阿维拉霉素的无盐体系流动相液相检测方法。首先为了提高Streptomyces viridoehrongenesN-0104菌株合成阿维拉霉素的产量,通过正交试验,并结合分段调控优化菌株罐上发酵过程中温度、pH、溶氧及补料等参数来实现。优化后的罐上发酵条件为:生长期温度为28℃,产素期温度为25℃;培养基消后pH7.1左右,产素期pH调控为7.5;生长期溶氧控制为30%,产素期溶氧控制为20%;发酵120 h后补加0.5%葡萄糖;同时在发酵过程中多次补加L-缬氨酸。采用优化后的罐上发酵条件开展菌株的罐上发酵,发酵10 d,阿维拉霉素的产量为1397.16 mg/L,较初始的产量(735.27 mg/mL)提高了 90.02%。然后建立阿维拉霉素组分的分离纯化路线,将阿维拉霉素组分的分离纯化过程设计为三个工段。第一工段:阿维拉霉素菌丝体的浸提。先准确称取一定质量的阿维拉霉素菌丝体(含量为200mg/g),1:30(m:V)的比例加入甲醇,100 Hz下超声90min,3000r/min离心10 min得上清液,备用。然后补水结晶、离心,40℃下烘干得阿维拉霉素粗提物。第二工段:阿维拉霉素的精纯。以硅胶为填料装柱,按阿维拉霉素粗提物与硅胶的质量比为1:50的比例称取阿维拉霉素粗提物。以3%的2-丙醇氯仿溶解上样,在1 mL/min的流速下先以一定体积3%2-丙醇氯仿洗脱,再以一定体积10%2-丙醇氯仿洗脱,分段收集。目标部分的洗脱液在40 ℃下旋转蒸发并烘干得阿维拉霉素一道纯化样品。第三工段:阿维拉霉素组分的分离。以十八烷基键合相硅胶(Octadecylsilyl,ODS)为填料装柱,取50mg(当填料质量为50 g时)阿维拉霉素一道纯化样品上柱,采用V(10mmol/L乙酸铵水溶液):V(乙腈)=55:45溶剂体系为洗脱剂洗脱,分段收集。目标部分的洗脱液分别加水重结晶,抽滤,晶体用纯水漂洗3次,40℃下烘干得到阿维拉霉素A组分样品和阿维拉霉素B组分样品。采用该分离纯化路线,阿维拉霉素菌丝体(含量为200 mg/g)分离纯化得到的阿维拉霉素单组分样品的回收率约为37.46%。其中在阿维拉霉素单组分样品中,阿维拉霉素A占93.42%,阿维拉霉素B占6.58%。并且经高效液相色谱及微生物检定法分析,初步认为阿维拉霉素A和阿维拉霉素B的单组分样品的纯度在97%以上。最后建立了阿维拉霉素的无盐体系流动相液相检测方法,确定的色谱条件为色谱柱:C18(150mm×2.1mm,5μm)柱,柱温:30℃,流速:0.2mL/min,检测波长:214nm,进样量:10μL,以梯度方法调整流动相A液(含0.1%(v/v)甲酸的水)与B液(含0.1%(v/v)甲酸的乙腈)的比例。在该色谱条件下,阿维拉霉素预混剂浸提样品中各组分分离效果较好,色谱峰峰型对称。经液质联用,确证了自制阿维拉霉素单组分对照品为阿维拉霉素A和阿维拉霉素B。进而以自制的阿维拉霉素单组分对照品对建立的液相方法在线性、精密度、回收率等方面进行验证。结果显示,阿维拉霉素A和B在10～1000 μg/mL浓度范围内线性良好,相关系数R2分别为0.9987和0.9979,相对标准偏差(RSD)分别为2.73%和2.44%,平均回收率分别为97.96%和98.50%。