在全脑尺度获取神经元精细结构,对解析复杂的大脑神经环路至关重要。近年来光学成像已成为获取介观神经元网络连接的重要手段。显微光学切片断层成像技术能够以微米体素分辨率成像小鼠全脑范围的脑连接,实现全脑范围单纤维的重建。在此基础上发展的化学层析成像,通过控制样本荧光蛋白的荧光淬灭和重激活,仅将样本的表层点亮至亚微米厚度,能高通量、高分辨率地获取小鼠全脑三维荧光图像,在解析介观神经环路精细连接中得以应用。然而目前这种方法仅适用于GFP/YFP单色标记的样本,其它颜色荧光蛋白难以适用,这限制了对神经环路精细结构的获取和研究。随着对荧光蛋白改造和修饰的不断深入,越来越多的新型荧光蛋白可能更适合用于神经元的标记和成像,但能否用于化学层析成像还很少有研究。更重要的是,生物学研究往往需要对样本同时进行多色标记与成像。那么多种荧光蛋白标记同一生物样本,经过树脂包埋后其荧光能否恢复,能否同时淬灭与重激活,多种荧光蛋白能否搭配使用实现多色成像,这些问题都需要研究。针对上述问题,本文在科技部973项目“灵长类神经回路精细结构成像的新方法和新工具”的支持下,开展了“适用于化学层析成像的多种荧光蛋白的筛选及应用”研究,以实现多色荧光蛋白化学层析成像来获取神经环路精细结构为导向,完成了以下工作内容:（1）筛选能适用于化学重激活方法的荧光蛋白。荧光蛋白经过树脂包埋后其荧光能被重激活是实现化学层析成像的基础。本文首先筛选了多种荧光蛋白,定性定量研究了荧光蛋白的来源和p Ka值、树脂的酸碱性及亲疏水性,对蛋白荧光重激活的影响规律。发现荧光蛋白能否被重激活与其来源无关,而与荧光蛋白的p Ka值、树脂的酸碱性及亲疏水性密切相关。进而提出了荧光蛋白选择及样本树脂包埋的策略:选用p Ka值较大的荧光蛋白进行生物标记,对树脂进行酸化,采用疏水性的Lowicryl HM20树脂,均能提高荧光蛋白重激活后的荧光强度。其中红色荧光蛋白p HOran4和深红色荧光蛋白m Kate,在Lowicryl HM20树脂中包埋,重激活后的荧光强度分别是包埋前的318%和296%。（2）建立操控荧光蛋白淬灭/重激活的实验方法并实现多种颜色荧光蛋白的单色化学层析成像。针对筛选出来的多种荧光蛋白标记的生物样本,本文通过精细调节其在树脂包埋过程中的酸淬灭参数,使多种荧光蛋白在GMA和Lowicryl HM20树脂中包埋,均能实现高重激活/淬灭（On/Off）荧光强度比,如td-Orange2的On/Off比高达81。在此基础上,对采用青色、红色和深红色荧光蛋白标记的鼠脑样本演示了单色化学层析成像能获取神经环路精细结构,尤其是针对红色荧光蛋白p HOran4标记的全脑样本获取的数据,能实现单神经元重建及突触结构分布的定量化统计。（3）实现了多色荧光蛋白同时化学层析成像,并应用于观测神经元精细结构。本文开发了双色病毒工具AAV2-h Syn-FLEx FRT m GFP-2A-Synaptophysin-p HOran4,采用GFP和p HOran4荧光蛋白分别标记神经纤维和突触前结构,演示了红绿双色同时化学层析成像,结合青色核酸染料PO-PROTM-1实时表面染色,同时获取神经元纤维投射和突触前等精细结构信息与细胞构筑信息。本课题面向多色荧光样本的标记和成像需求,基于多种荧光蛋白实现了化学层析成像,可同时获取神经元多种精细结构。多色荧光蛋白化学层析成像将成为单细胞水平研究神经环路连接的有利工具,不仅在脑科学领域有重要的应用前景,在生命科学其他领域的应用也有重要意义。