目的:观察葛根芩连汤对非酒精性脂肪性肝炎相关脂质代谢及炎症的影响,并探讨其作用机制。方法:1.体内实验:采用高脂饲料连续喂养24周建立NASH模型,给予葛根芩连汤高剂量(GGQLD-H,11.2 g/kg·d)、葛根芩连汤中剂量(GGQLD-M,3.73 g/kg·d)、葛根芩连汤低剂量(GGQLD-L,1.24 g/kg·d)和吡格列酮(Pioglitazone,5.25mg/kg·d)干预7周,比色法测定血清TG、CHO、LDL-C、TBA、LPS、NEFA水平,HE染色观察肝组织脂肪变、炎症及气球样变程度,以评价葛根芩连汤疗效。2.体外实验。(1)以Hep G2细胞为对象,用游离脂肪酸(棕榈酸:油酸=1:2)处理24h建立NASH体外模型,用不同浓度葛根芩连汤含药血清干预,油红O染色及检测胞内TG含量来观察细胞内脂肪变性情况;ELISA法测定培养上清液中IL-6的水平;q RT-PCR和WB检测TLR4基因及蛋白的相对表达量。(2)采用转录组学技术分析RAW264.7细胞炎症模型经葛根芩连汤含药血清干预后的影响,对差异基因进行GO分类、KEGG Pathway富集等生物信息学分析,再结合文献得出葛根芩连汤防治NASH作用的潜在靶点,并采用q RT-PCR技术对部分差异基因进行验证。(3)采用蛋白质组学技术分析RAW264.7细胞炎症模型经葛根芩连汤含药血清干预后的影响,运用DAVID、String数据库对差异蛋白进行生物信息学分析,再结合文献得出可能的生物标志物。结果:1.(1)大鼠体质量及病理形态学:模型组大鼠每周体质量比正常组大鼠明显增加,病理切片显示有明显的脂肪变性、炎症细胞浸润及肝细胞气球样变,NAS计分大于5,较正常组显著升高(P<0.01);与模型组比较,葛根芩连汤各组体质量均有所下降,但无显著性差异,药物干预各组肝组织病理状态均有不同程度的改善,其中葛根芩连汤高、低剂量组NAS计分显著下降(P<0.05,P<0.01)。(2)血清生化指标:模型组血清TG、CHO、LDL-C、NEFA、LPS、TBA水平均显著高于正常组(P<0.01,P<0.05);葛根芩连汤高剂量组血清TG、CHO、LDL-C、NEFA、LPS、TBA,中剂量组血清LPS、TBA,低剂量组血清TG、CHO、LPS、TBA及吡格列酮组血清TG、CHO、NEFA、LPS、TBA水平较模型组显著降低(P<0.01,P<0.05)。2.(1)油红O染色及胞内TG:经FFA处理后细胞内红色脂滴颗粒增多、增大,TG水平较对照组也显著升高(P<0.01);药物干预组细胞内红色脂滴较FFA组有不同程度的减少,葛根芩连汤干预组TG水平也显著降低(P<0.01)。ELISA法结果显示:模型组IL-6水平较对照组明显升高(P<0.05);葛根芩连汤各剂量组和吡格列酮组IL-6水平较模型组均显著降低(P<0.05)。RT-PCR及WB结果显示:模型组TLR4 m RNA及蛋白表达水平较对照组显著升高(P<0.01,P<0.05),与模型组相比,葛根芩连汤高、中剂量组TLR4 m RNA及蛋白表达显著下调(P<0.01,P<0.05),葛根芩连汤低剂量组和吡格列酮组TLR4蛋白表达显著下调(P<0.05,P<0.01)。(2)转录组学分析:鉴定得到293个差异表达基因,其中274个表达上调,19个表达下调。生物信息学分析及相关文献查阅后,得出葛根芩连汤改善NASH作用的可能靶点,分别为Mat1a、Hnf4α、Cbs、Pparα基因,并对其部分基因进行了q RT-PCR验证,结果显示:与对照组相比,模型组Hnf4αm RNA、Cbs m RNA、Pparαm RNA均表达下调(P<0.01),与模型组相比,葛根芩连汤高、低剂量均能不同程度的升高Hnf4αm RNA、Cbs m RNA、Pparαm RNA的表达水平,其变化趋势与转录组研究结果一致。(3)蛋白质组学分析:数据处理后获得1424个差异表达蛋白,其中755个表达上调,669个表达下调。经生物信息学分析及文献查阅得到与NASH相关的差异表达蛋白有Ldlr、Nos3、Lpin3、Mapk14这4个。对上述蛋白进行网络互作分析显示,仅有Ldlr、Mapk14和Nos3蛋白参与互作。结论:1、葛根芩连汤可改善NASH相关脂肪变性、炎症等反应,其中TLR4信号通路可能是其改善炎症的一条途径。2、组学研究得出的Mat1a、Hnf4α、Cbs、Pparα基因和Ldlr、Nos3、Mapk14蛋白,可能是葛根芩连汤发挥治疗NASH作用的潜在靶点。