研究背景:急性心肌梗塞（Acute Myocardial Infarction,AMI）是全球致残和死亡的主要原因,其发病率和死亡率始终居高不下,威胁着全人类的健康。干细胞移植修复损伤心肌、促进心肌细胞再生已在大量动物模型中得到验证,但其在体内的分布、迁移、存活和分化的机制仍不明确。有研究证实,心肌梗死后炎症的发生,通常以旁分泌的形式介导损伤的继续恶化。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）、黑色素瘤缺乏因子2（Absent In Melanoma2,AIM2）等炎性小体在AMI后3-24小时内在心肌中形成,参与炎症反应并加重缺血再灌注损伤。实验研究表明,靶向炎性体治疗可能是减少急性心肌梗死体积和预防心肌梗死后心力衰竭的可行策略。骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cell,BMSCs）因其来源丰富,能够自我更新,具有多向分化潜能及免疫原性低,是心梗治疗的种子细胞,但其作用机制尚不明确,目前研究人员更倾向于研究干细胞的旁分泌作用发挥其保护作用,这类旁分泌分泌因子中包含了外泌体（Exosomes）的研究。骨髓间充质干细胞来源的外泌体（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell exosomes,BMSCs-Exo）通过细胞-细胞通讯被认为是一种新的细胞免疫疗法,我们推测BMSCs-Exo可能通过细胞-细胞通讯改善心肌梗死后心功能不全的发生。研究目的:本研究采用结扎大鼠心脏前降支动脉（Left Anterior Descending Artery,LAD）诱导大鼠急性心肌梗死为模型,研究骨髓间充质干细胞来源的外泌体调控心肌梗死后细胞焦亡的具体作用机制。为心肌梗死后心衰以及心脏修复机制提供了一定的理论依据,同时可能对外泌体载体干预治疗提供新的靶点。研究方法与结果提取大鼠的骨髓间充质干细胞进行分离和培养,在体外使用DMEM-F12培养基培养,观察其形态学特征,同时使用流式细胞术进行表面标记物的鉴定,明确BMSCS是否诱导成功;观察大鼠BMSCs生长状况,描述其生长曲线。结果发现贴壁细胞多为长梭形或三角形、多边形成纤维样细胞,排列成簇状生长,整齐有方向性。流式细胞术鉴定大鼠BMSCs表面的标记抗原,CD29、CD90阳性、CD34和MHCⅡ PE阴性;传代细胞贴壁后在第3-7d快速生长,其表现为生长曲线呈“S”型。在成功提取了 BMSCs后,采用状态良好的第三代大鼠骨髓间充质干细胞,从其培养液的上清内抽提外泌体进行外泌体的鉴定。结果发现,外泌体在透射电镜下观察到直径不一的圆形或者椭圆形,具有脂质双分子层的“杯托”样结构,粒径在20-140nm。通过Western Blot检测外泌体表面特异性标志物CD63和CD9、TSG101表达明显升高。在成功提取BMSCs来源的外泌体后进行了进一步的研究,成功诱导了大鼠急性心肌梗死的模型,用提取的外泌体进行心肌梗死区域的局部注射。研究发现,心肌梗死术后第1d、7d,PBS组、BMSCs-Exo组心功能均呈现显著下降的趋势,从第7d起直至术后第28d,BMSCs-Exo组大鼠的EF和FS呈升高趋势。行组织学检查（HE染色、Masson染色）,结果提示BMSCs-Exo治疗组心肌细胞坏死、炎性细胞浸润、纤维化程度较对照组明显改善,提示BMSCs-Exo能显著促进大鼠心功能的恢复。为了进一步探讨BMSCs-Exo改善心肌梗死后的作用机制,本研究首先明确了大鼠急性心肌梗死后有无发生细胞焦亡,分别从体内、体外进行了相关模型的验证。研究发现在大鼠心肌梗死后3天检测到了心肌细胞焦亡相关蛋白NLRP3、AIM2、Caspase-1（半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1）的高表达;体外实验中我们使用H2O2诱导H9C2心肌细胞焦亡,同时检测了与细胞焦亡相关的基因包括NLRP3、Caspase-1、IL-18以及IL-1B。模型诱导成功后,验证外泌体对心肌细胞焦亡的作用,结果发现,适当浓度的BMSCs-Exo可以明显抑制焦亡相关炎症因子（AIM2、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18）。最后,为了进一步探讨BMSCs-Exo的作用机制,结合前期的外泌体测序分析结果,应用生物信息学分析发现,BMSCs-Exo中高表达miR-143-3p,在本研究中均得到证实;而后通过蛋白质印迹实验（Western blot）检测大鼠心梗后外泌体治疗组与过表达miR-143-3p外泌体组AIM2的表达水平减低;外泌体与心肌细胞共培养后24小时,诱导心肌细胞焦亡。提取细胞的总RNA,对AIM2下游的炎症因子通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测,研究结果发现:予以miR-143-mimics处理组（EXOmiR-143-mimics 组）的 Caspase-1、IL-18、IL-1B 表达量较低;而在 miR-143-inhibitor 处理组（EXOmiR-143-inhibitor 组）的 Caspase-1、IL-18、IL-1B 的表达量升高。这些数据结合前面的研究结果表明,BMSCs-Exo可能将miR-143-3p携带到MI组织和细胞中,靶向抑制AIM2/caspase1/IL-1β/IL-18信号轴并可能调节心肌梗死后的细胞焦亡。结论:本研究结果发现,急性心肌梗死可以导致心肌细胞焦亡相关蛋白的升高,而BMSCs-Exo能有效抑制急性心肌梗死后心肌细胞焦亡相关蛋白的表达;BMSCs可能通过外泌体将miR-143-3p传送到心肌细胞中,靶向抑制AIM2/caspase1/IL-1β/IL-18信号轴并可能调节心肌梗死后的细胞焦亡,从而修复受损心肌,改善心脏功能。本研究为心肌梗死后心衰以及心脏修复机制提供了一定的理论依据,同时可能对外泌体载体干预治疗提供新的靶点。