豆豉纤溶酶高产菌株的筛选、发酵条件优化及酶的分离纯化

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiao_zhuang_lin
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豆豉是我国传统的大豆发酵食品,作为调味品在中国食用已久。豆豉纤溶酶是从豆豉中提取出来的一种具有较高纤溶活性的酶,该酶抗凝、溶栓、不溶解血细胞、不引起内出血、体内半衰期长,而且可通过消化道直接吸收。另外豆豉纤溶酶可通过发酵进行大量生产,正是由于豆豉纤溶酶重要的药用价值和良好的应用前景,其有望被开发成为新一代溶栓、防栓药物。本论文取8个不同来源的豆豉样品,经自制酪素平板初筛、纤维蛋白平板复筛,筛选出5株有较高纤溶活性的菌株。其中菌株YH56粗酶液的酶活最高,达到280IU/ml。采用16S rRNA序列分析法及传统的生理生化特征鉴定法对该菌株进行鉴定,确定菌株YH56为枯草芽孢杆菌。利用单因素实验和正交分析方法,优化得到枯草芽孢杆菌YH56产豆豉纤溶酶的最佳发酵条件:pH值7.0,35℃摇瓶150rpm培养60h,接种量4%,种龄18h,装液量40ml/250ml。在此发酵条件下,该菌产生的纤溶活性可达到880IU/ml。最佳发酵培养基组分为:胰蛋白胨2%,葡萄糖2%,MgSO40.07%,CACl20.04%,NaH2PO40.1%,Na2HPO40.3%。枯草芽孢杆菌YH56发酵液经25%-65%(NH42SO4分段盐析、DEAE-Sepharose FastFlow阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤,可获得电泳纯的豆豉纤溶酶。每升发酵液经过一系列的分离纯化,可获得3.4mg活性蛋白,蛋白活力达9033.07IU/ml,纯度提高为发酵原液的12.54倍,回收率为8.7%。该纯化蛋白酶是由枯草芽孢杆菌YH56所产生的纤溶酶,因此将其命名为YH56-FE。经过SDS-PAGE分析,纤溶酶YH56-FE的相对分子量约为28kD。纤溶酶YH56-FE的最适反应温度为42℃,最适反应pH为9.0。该研究丰富了豆豉纤溶酶酶学基础理论知识,为溶栓药物和保健食品的开发和应用奠定基础。
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