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第一部分头孢曲松耐药淋球菌镶嵌型penA基因突变株构建
目的:构建交换镶嵌型penA10.001和penA60.001头孢曲松耐药淋球菌突变株
方法:构建大肠杆菌重组质粒pUC57-penA10.001-kanarpsL-down和pUC57-penA60.001-kanarpsL-down，采用二次同源重组反向筛选完整交换两株临床分离菌株SZ20(penA60.001)和SRRSH78(penA10.001)的镶嵌型penA基因。
结果:通过二次同源重组反向筛选方法成功将对头孢菌素高度耐药的SZ20(penA60.001)的镶嵌型penA基因置换成SZ20(penA10.001)突变株，同样原理将对头孢曲松敏感性降低的SRRSH78(penA10.001)的镶嵌型penA基因置换成SRRSH78(penA60.001)突变株，通过PCR验证后并予以全penA基因序列测序验证。
结论:采用含有双重抗生素筛选标记的重组质粒进行二次同源重组反向筛选法不带入任何影响淋球菌其他外源基因精准置换淋球菌镶嵌型penA基因。
关键词:淋球菌;penA10.001;penA60.001;转化;同源重组
第二部分镶嵌型penA基因突变对淋球菌头孢曲松高度耐药及体外生物适应度代价相关研究
目的:通过对比研究含有penA60.001的FC428克隆株与全球广泛传播含有penA10.001的头孢曲松低敏菌株对头孢曲松耐药影响及生物适应度差异
方法:使用琼脂稀释法测定转化成功的淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)对头孢克肟、头孢曲松MIC值，使用普通液体培养法测定不同时间淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)生长情况，在液体培养环境中加入压力胁迫条件测定不同时间段淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)的生长情况，使用spotsassay测定淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)在压力胁迫条件生长活力，使用普通液体培养体外竞争实验及压力胁迫条件体外竞争实验比较淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)适应性生长能力。
结果:在对淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)对头孢菌素MIC分析表明，含有penA60.001的突变体与含有penA10.001的异基因突变体相比，头孢曲松和头孢克肟的最小抑制浓度(MICs)高8至16倍。进一步的生物适应性分析表明，单株体外液体生长和竞争是相同的等基因笔A等位基因交换突变体。然而，在高浓度的棕榈酸或石胆酸存在下，当作为单株生长时，含有penA60.001的突变体生长得更好，而含有等生penA10.001的突变体则更好。相反，penA10.001突变体在竞争中生长时，在较低浓度的棕榈酸及胆酸环境下超过了penA60.001突变体。
结论:等位基因penA60.001对FC428克隆的头孢曲松耐药性至关重要，而其对生物适应度的影响取决于特定的生长条件。
关键词:头孢曲松;FC428;penA10.001;生物适应性
第三部分镶嵌型penA基因的淋球菌野生株与突变株体内竞争实验
目的:成功建立淋球菌动物感染模型并比较淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)在体内竞争情况。
方法:使用清洁级BACL雌性小鼠发情前期予以雌激素皮下注射，建立小鼠阴道感染淋球菌动物模型。在已建立的动物模型分别进行淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)体内等量侵染，共在2组小鼠中进行，每组选择6只小鼠，侵染成功后每日取小鼠阴道样本进行比较，观察体内竞争生存情况。
结果:在淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)等量侵染小鼠组，平均感染时间为4.5天;在野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)等量侵染小鼠组，平均感染时间为5.5天，在侵染SZ20小鼠组内显示突变株SZ20(penA10.001)体内定植和存活优于野生株SZ20(penA60.0011);在侵染SRRSH78小鼠组内显示野生株SRRSH78(penA10.001)体内定植和存活优于突变株SRRSH78(penA60.001)。
结论:总之等位基因penA60.0011在小鼠体内模拟生物适应度较等位基因penA10.001较弱，与体外压力胁迫条件培养及体外竞争实验结果不一致。
目的:构建交换镶嵌型penA10.001和penA60.001头孢曲松耐药淋球菌突变株
方法:构建大肠杆菌重组质粒pUC57-penA10.001-kanarpsL-down和pUC57-penA60.001-kanarpsL-down，采用二次同源重组反向筛选完整交换两株临床分离菌株SZ20(penA60.001)和SRRSH78(penA10.001)的镶嵌型penA基因。
结果:通过二次同源重组反向筛选方法成功将对头孢菌素高度耐药的SZ20(penA60.001)的镶嵌型penA基因置换成SZ20(penA10.001)突变株，同样原理将对头孢曲松敏感性降低的SRRSH78(penA10.001)的镶嵌型penA基因置换成SRRSH78(penA60.001)突变株，通过PCR验证后并予以全penA基因序列测序验证。
结论:采用含有双重抗生素筛选标记的重组质粒进行二次同源重组反向筛选法不带入任何影响淋球菌其他外源基因精准置换淋球菌镶嵌型penA基因。
关键词:淋球菌;penA10.001;penA60.001;转化;同源重组
第二部分镶嵌型penA基因突变对淋球菌头孢曲松高度耐药及体外生物适应度代价相关研究
目的:通过对比研究含有penA60.001的FC428克隆株与全球广泛传播含有penA10.001的头孢曲松低敏菌株对头孢曲松耐药影响及生物适应度差异
方法:使用琼脂稀释法测定转化成功的淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)对头孢克肟、头孢曲松MIC值，使用普通液体培养法测定不同时间淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)生长情况，在液体培养环境中加入压力胁迫条件测定不同时间段淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)的生长情况，使用spotsassay测定淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)在压力胁迫条件生长活力，使用普通液体培养体外竞争实验及压力胁迫条件体外竞争实验比较淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)适应性生长能力。
结果:在对淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)对头孢菌素MIC分析表明，含有penA60.001的突变体与含有penA10.001的异基因突变体相比，头孢曲松和头孢克肟的最小抑制浓度(MICs)高8至16倍。进一步的生物适应性分析表明，单株体外液体生长和竞争是相同的等基因笔A等位基因交换突变体。然而，在高浓度的棕榈酸或石胆酸存在下，当作为单株生长时，含有penA60.001的突变体生长得更好，而含有等生penA10.001的突变体则更好。相反，penA10.001突变体在竞争中生长时，在较低浓度的棕榈酸及胆酸环境下超过了penA60.001突变体。
结论:等位基因penA60.001对FC428克隆的头孢曲松耐药性至关重要，而其对生物适应度的影响取决于特定的生长条件。
关键词:头孢曲松;FC428;penA10.001;生物适应性
第三部分镶嵌型penA基因的淋球菌野生株与突变株体内竞争实验
目的:成功建立淋球菌动物感染模型并比较淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)在体内竞争情况。
方法:使用清洁级BACL雌性小鼠发情前期予以雌激素皮下注射，建立小鼠阴道感染淋球菌动物模型。在已建立的动物模型分别进行淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)和野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)体内等量侵染，共在2组小鼠中进行，每组选择6只小鼠，侵染成功后每日取小鼠阴道样本进行比较，观察体内竞争生存情况。
结果:在淋球菌野生株SZ20(penA60.001)/突变株SZ20(penA10.001)等量侵染小鼠组，平均感染时间为4.5天;在野生株SRRSH78(penA10.001)/突变株SRRSH78(penA60.001)等量侵染小鼠组，平均感染时间为5.5天，在侵染SZ20小鼠组内显示突变株SZ20(penA10.001)体内定植和存活优于野生株SZ20(penA60.0011);在侵染SRRSH78小鼠组内显示野生株SRRSH78(penA10.001)体内定植和存活优于突变株SRRSH78(penA60.001)。
结论:总之等位基因penA60.0011在小鼠体内模拟生物适应度较等位基因penA10.001较弱，与体外压力胁迫条件培养及体外竞争实验结果不一致。