第一部分废用性骨质疏松动物模型的建立与评价研究背景：机械应力是维持骨量的重要因素。缺乏机械应力刺激可以导致局部或者全身骨量丢失和骨微结构破坏,从而产生废用性骨质疏松。废用性骨质疏松的建模方式有多种,其中坐骨神经切断术是最常用的方式之一。研究目的：本部分实验分别对雄性、雌性大鼠行坐骨神经切断术,通过术后大鼠活动情况、骨量及骨微结构的变化对该废用性骨质疏松模型进行评价。实验方法：12周龄雄性、雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠各32只,分别随机分为：废用组(disuse, DIS)和对照组(control, CTRL);又根据处死时间,分为2周组和8周组(n=8)：即2w-CTRL,2w-DIS,8w-CTRL,8w-DIS。对雄性、雌性废用组大鼠行双侧坐骨神经切断术,于术后1天(1d)、2周(2w)、8周(8w)评价大鼠下肢活动能力,并于术后2周、8周处死动物。Micro-CT和/或组织形态学分析胫骨近中骨量及骨微结构的变化,即骨体积百分率(BV/TV)、骨表面密度(BS/TV)、骨表面积体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁间隔(Tb.Sp)。实验结果：(1)雄性、雌性大鼠的髋关节屈曲和伸展活动能力及膝关节伸展活动能力在坐骨神经切断术后早期均受到影响,评分下降,但术后2周恢复正常,8周结果相同；踝关节屈曲和伸展运动能力及膝关节屈曲运动能力在坐骨神经切断术后,功能完全丧失,评分为0,并且术后2周和8周结果均为O。(2) Micro-CT分析表明,雄性、雌性DIS组大鼠均出现明显的骨量丧失,骨小梁厚度(Tb.Th)显著减小。雄性、雌性大鼠micro-CT分析的结果基本一致。(3)组织形态学分析表明,与相应的对照组相比,雄性、雌性大鼠2w-DIS、8w-DIS组的骨量均显著降低,与micro-CT分析的结果基本一致。实验结论：(1)坐骨神经切断术建立大鼠废用性骨质疏松模型切实可行；(2)性别对废用性骨质疏松大鼠模型的建立无明显影响。第二部分废用性骨质疏松的位点特异性骨反应研究背景：骨硬化蛋白(sclerostin)是SOST基因编码的分泌性糖蛋白,由骨细胞特异性表达,是骨形成的负性调节因子。机械应力的变化可以引起骨硬化蛋白/SOST表达的改变,但是以往的研究结果并不一致,呈现出众说纷纭的现象。研究目的：多数关于机械应力与骨硬化蛋白/SOST的研究集中在单个位点上。鉴于长骨的轴向生长导致同一骨内细胞年龄不同,进而对机械应力刺激具有不同的敏感性。我们推断骨硬化蛋白/SOST对机械应力反应的多样性结果是由于研究的部位和年龄上的差异引起的。本部分实验假设机械应力刺激下,骨转换具有位点特异性,甚至年龄特异性。实验方法：12周龄雄性SD大鼠32只,分组同第一部分,即2w-CTRL,2w-DIS, 8w-CTRL,8w-DIS。到期处死动物,micro-CT和组织形态学评价大鼠胫骨不同位点的骨量、骨微结构的变化；免疫组织化学、实时荧光定量PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qPCR)和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)评价不同部位或全身系统骨硬化蛋白/SOST的表达；抗酒石酸酸性磷酸酶5b (tartrate resistant acid phosphatase 5b, TRAP 5b)染色、ELISA分别评价不同位点破骨细胞Oc. S/N. Oc (osteoclast surface/osteoclast number)、Oc. S/BS (osteoclast surface/bone surface)、N. Oc/B. Pm (osteoclast number/bone perimeter)的变化以及血清TRAP 5b的变化。检测I型胶原羧基末端肽(C-terminal telopeptides of type I collagen, CTx)的血清含量来评价破骨细胞的骨吸收活性。实验结果：(1) Micro-CT和(或)组织形态学分析表明,DIS组大鼠较CTRL组大鼠所有检测位点骨量丧失均有显著性差异。(2)与对照组相比,2w一和8w-DIS组骨干中段SOST mRNA表达均显著下调。相反,2w-和8w-DIS组远离生长板5-6mm区域的骨硬化蛋白表达均显著上调；在2.5-3.5mm区域与相应对照组相比无显著差别；然而在0.5-1.5mm区域8w-DIS组表达下调,2w-DIS组无显著变化,同时8w-CTRL组较2w-CTRL组显著增加。血清骨硬化蛋白/SOST的变化趋势与0.5-1.5mm区域相似,即2w-DIS较2w-CTRL无差异,8w-DIS较8w-CTRL下调。(3)废用导致2w-DIS与8w-DIS组初级骨小梁Oc. S/N. Oc、Oc. S/BS参数较相应对照组均明显增加,而N. Oc/B. Pm无显著差异；而次级骨小梁Oc. S/N.Oc、 Oc.S/BS、N. Oc/B. Pm在2w-DIS均较对照组显著增加,8w-DIS较对照组无显著变化,该趋势与骨微结构的变化可能相关。破骨细胞数量的标志物一血清TRAP 5b在2w-DIS组与2w-CTRL间无显著差异,8w-DIS较8w-CTRL组显著减少。破骨细胞活性的标志物一血清CTx的水平2w-DIS组较2w-CTRL组显著增加,而8w-DIS组较8w-CTRL组无显著差异。实验结论：(1)废用导致胫骨骨量及骨微结构的变化在不同位点的趋势基本一致；(2)骨细胞表达骨硬化蛋白/SOST具有位点特异性和时间特异性；(3)破骨细胞对废用的反应也依据位点的不同表现不同。本部分实验表明,废用性骨质疏松可以导致位点特异性的骨反应。第三部分去势联合废用对骨质的影响研究背景：雌激素、机械应力是骨代谢平衡强有力的调控因素。50岁或50岁以上的女性大量患有骨质疏松,75岁以上的女性骨质疏松发病率几乎达到90%。频发的心脑血管疾病、事故导致众多的老年女性出现截瘫、偏瘫、卧床。然而,至今罕见对雌激素缺乏同时伴有行动不便的人群进行骨质疏松的研究。研究目的：通过建立去势联合废用的动物模型,评价去势联合废用双因素作用下骨质疏松的渐进性发展以及骨转换指标随时间的变化。研究方法：10周龄雌性SD大鼠96只,随机分为3组(n=32),每组又根据术后3天,7天,14天,28天不同时间分为4个亚组(n=8)。第一组：双侧卵巢切除术+右后肢坐骨神经切断术(OVX+SN);第二组：假性双侧卵巢切除术+右后肢坐骨神经切断术(sham-OVX+SN);第三组：假性双侧卵巢切除术(sham-OVX),作为对照组(CTRL),为避免手术创伤造成的假性废用,不做假性坐骨神经切断术。Micro-CT和组织形态学评价大鼠胫骨骨量、骨微结构的渐进性变化,分析骨体积百分率(BV/TV)、骨表面密度(BS/TV)、骨表面积体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁间隔(Tb. Sp)的渐进性变化；免疫组织化学、实时荧光定量PCR (qPCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)评价胫骨局部或全身系统骨硬化蛋白／SOST的表达；抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRAP 5b)染色、ELISA分别评价胫骨局部破骨细胞Oc. S/N.Oc、Oc.S/BS、N. Oc/B. Pm的变化以及血清TRAP 5b的变化。另外,ELISA检测CTx、核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor κB ligand, RANKL)、脂联素(adiponectin)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的血清学的渐进性变化。实验结果：(1) Micro-CT分析显示：与CTRL组相比,sham-OVX+SN. OVX+SN组大鼠骨体积百分率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)随着术后时间的延长逐渐下降；骨小梁间隔(Tb. Sp)随着时间的延长逐渐增加。OVX+SN组较sham-OVX+SN组变化更加明显、迅速。组织形态学BV/TV分析显示的结果与micro-CT一致。(2)免疫组织化学分析,sham-OVX+SN组局部骨硬化蛋白的表达随着时间的延长呈上升趋势,至术后28天与CTRL组相比差异显著；OVX+SN组在术后7天与CTRL组相比即显著增加,随后一直保持高水平的骨硬化蛋白表达。与CTRL组相比,骨干中段SOST mRNA的表达在OVX+SN组呈现先增加后下降的趋势,即在7天表达升高,28天表达下降；sham-OVX+SN组在14天呈现表达升高。血清骨硬化蛋白的表达,sham-OVX+SN、OVX+SN组与CTRL组相比在术后3、7、14、28天均无显著性差异。(3) OVX+SN组破骨细胞相关参数Oc.S/N.Oc、 Oc. S/BS显示在术后3天至14天逐渐增加,且与对照组相比皆具有统计学差异,术后28天减小且无显著差异；N. Oc/B. Pm在术后7天较对照组显著增加,而3天、14天、28天虽有变化但无明显差异。sham-OVX+SN组Oc. S/N.Oc、Oc.S/BS随着术后时间延长逐渐增加,至术后28天Oc. S/N. Oc较对照组差异显著,Oc.S/BS虽有增加趋势,但无显著差异；N. Oc/B. Pm在术后3、7、14、28天较对照组均无统计学差异。(4) OVX+SN组血清CTx随着术后时间的延长逐渐增加,至14天达峰值,较对照组差异显著,而28天降低至正常水平；sham-OVX+SN组血清CTx较对照组无显著差异。OVX+SN组血清RANKL在术后28天较对照组显著增加,而sham-OVX+SN较对照组均无显著性差异。实验结论：(1)雌激素的缺乏与机械非负荷的联合作用导致了骨量迅速明显地下降；(2)去势与废用的联合作用增加了破骨细胞的活性和面积；(3)去势与废用的联合作用不仅增加了骨细胞阳性表达骨硬化蛋白的百分率,同时加速了该过程的进程。第四部分雌激素替代治疗对去势联合废用性骨质疏松的影响研究背景：雌激素替代治疗是治疗骨质疏松症最有效的方法之一,主要适用于预防和治疗绝经后女性骨质疏松。庞大的绝经后女性人群以及频发的事故、心脑血管疾病导致雌激素缺乏同时伴有行动不便的患者与日俱增。但雌激素替代治疗的风险亦越来越受关注,鉴于此,有必要研究雌激素替代治疗如何影响行动不便的绝经后女性患者的骨转换,以便探讨对于此类患者应用雌激素替代治疗来保持骨量的必要性。研究目的：通过建立去势联合废用的大鼠模型,评价雌激素替代治疗在去势与废用双因素作用下骨质疏松渐进性发展中的影响。研究方法：10周龄雌性SD大鼠128只,随机分为4组(n=32)：去势+废用+17β-雌二醇干预组(OVX+SN+E2);其他3组来自第三部分,即假性去势作为对照组(CTRL);假性去势+废用组(sham-OVX+SN);去势+废用组(OVX+SN)。根据不同时间点每组又分为3天组、7天组、14天组和28天组,到期处死动物。检测方法同第三部分。实验结果：(1)Micro-CT及组织形态学分析显示：与CTRL组相比,sham-OVX+SN、 OVX+SN、OVX+SN+E2组大鼠骨体积百分率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)随着术后时间的延长逐渐下降；骨小梁间隔(Tb.Sp)随着时间的延长逐渐增加。与OVX+SN相比, OVX+SN+E2在术后14天BV/TV多保存了46%(micro-CT)和58%(组织形态学)；Tb.Th多保存了14%; Tb.N多保存了47%；Tb.Sp少增加了24%。而术后28天,OVX+SN+E2与OVX+SN组在BV/TV、Tb. Th、 Tb.N、Tb.Sp等参数水平基本保持一致。(2)局部骨硬化蛋白表达的免疫组织化学分析：OVX+SN组在术后7天与CTRL组相比即显著增加,随后一直保持高水平的骨硬化蛋白表达；OVX+SN+E2组在术后7天与CTRL组相比无显著性差异,术后14天、28天显著增加。与CTRL组相比,骨干中段SOST mRNA的表达在OVX+SN、OVX+SN+E2组均呈现先增加后下降的趋势。(3)破骨细胞分析中,OVX+SN+E2与sham-OVX+SN组Oc. S/N. Oc呈现相似趋势,均随时间延长逐渐增加；OVX+SN+E2术后7天至28天较对照组均显著增加,然而增加幅度明显小于OVX+SN组。OVX+SN+E2组Oc. S/BS随着时间的延长呈增加趋势,至术后28天较对照组显著增加。OVX+SN+E2组N. Oc/B. Pm在术后3、7、14、28天较对照组均无统计学差异。(4) OVX+SN组血清CTx随着术后时间的延长逐渐增加,至14天较对照组差异显著,而28天降低至正常水平；OVX+SN+E2和sham-OVX+SN组血清CTx较对照组均无显著差异。 OVX+SN与OVX+SN+E2组血清RANKL在术后28天较对照组显著增加,而sham-OVX+SN较对照组均无显著性差异。实验结论：(1)雌激素替代治疗暂时性预防了废用联合去势双因素作用下的骨质疏松的发生。然而,长期治疗需持慎重态度。骨代谢标志物一血清CTx与RANKL在一定程度上暗示了骨质疏松破坏的程度；(2)雌激素替代治疗延缓了局部骨硬化蛋白的表达；(3)雌激素替代治疗抑制了废用与去势双因素作用下的破骨细胞的活动。