论文部分内容阅读
多胺作为一种起调控作用的物质,参与植物开花、果树坐果及果实发育等多个生理过程。玛瑙红樱桃是贵州选育的优良品种,果实品质优、丰产性好、耐贮运、产业价值高因而在西南等地区广泛种植。但是其果实产量容易受寒冻及暴雨等恶劣天气的影响,因此在生产上,避雨栽培是提高樱桃果实产量及品质的有效措施。前期工作中,课题组对避雨栽培下玛瑙红樱桃叶片及果实进行了转录组数据分析,结果表明,避雨条件下多胺代谢相关酶基因显著上调表达。为深入探讨多胺代谢相关基因的表达与玛瑙红樱桃果实发育的关系,本文拟克隆亚精胺合成酶(CpSPDS)和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(CpSAMDC)基因的c DNA全长序列,对CpSPDS基因进行亚细胞定位分析,进一步分析该基因在不同组织的表达情况以及多胺的含量变化;构建了CpSPDS和CpSAMDC基因的植物表达载体,并遗传转化拟南芥。主要结果如下:1)利用RT-PCR技术从玛瑙红樱桃中克隆了亚精胺合成酶基因的c DNA全长序列,命名为CpSPDS,登录号:MK045261,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的c DNA全长序列,命名为CpSAMDC,登录号为:MK045262。CpSPDS c DNA序列全长1,243 bp,含10个开放阅读框(ORF),其中最长ORF为1,101bp,编码含366个aa的SPDS酶原;聚类分析表明,CpSPDS与甜樱桃(XP＿021826297Prunus avium)、桃(XP＿020413638 Prunus persica)中该蛋白的序列一致性最高,分别为100%和99%。CpSAMDC c DNA全长1,698 bp,含12个ORF,其中最长ORF为1,074 bp,编码含357个aa的SAMDC酶原;CpSAMDC与甜樱桃(XP＿021815173 Prunus avium)、桃(XP＿007225621 Prunus persica)和梅(XP＿016652167 Prunus mume)的同源关系最高,分别为98%、97%和97%。2)CpSAMDC及CpSPDS蛋白属于不稳定亲水蛋白,无跨膜运动,为非分泌型蛋白;CpSPDS具有典型的亚精胺合成酶结构,CpSAMDC具有典型的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶结构。采用瞬时表达技术将CpSPDS与GFP融合蛋白导入拟南芥(Arabidopsis thaliana)原生质体中,结果表明融合蛋白在细胞核和细胞质中均出现荧光,说明CpSPDS基因的产物主要在细胞内起作用,与生物信息学预测结果一致。3)qRT-PCR分析显示,CpSPDS及CpSAMDC在不同组织中均有表达。避雨栽培下,花蕾、幼果、成熟果及成熟叶片中CpSPDS及CpSAMDC的表达量均高于露地栽培,同转录组数据分析结果相符,这暗示了CpSPDS及CpSAMDC基因可能参与樱桃坐果及果实发育。4)避雨栽培下,花蕾、幼果、成熟果及成熟叶片的腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)的含量均高于露地栽培,棚内花蕾和幼果中Spd含量分别是棚外的3.29倍和2.46倍;棚内花蕾中Spm含量是棚外的2.75倍,成熟果实和叶片中Spm含量分别是棚外的1.26倍和1.91倍。在花蕾中,Put含量约为棚外花蕾的1.62倍,在幼果中,其含量约为棚外幼果的1.35倍。在叶片上,棚内和棚外的Put含量没有显著性差异。在成熟果实中,棚内的Put含量比棚外高1.30倍左右。5)构建了pCAMBIA1301-CpSPDS和p CAMBIA1301-CpSAMDC植物表达载体,并用花絮侵染法法遗传转化拟南芥哥伦比亚野生型,获得了转p CAMBIA1301-CpSPDS和p CAMBIA1301-CpSAMDC基因的拟南芥株系各8个;在转CpSPDS的8个株系中,4号的CpSPDS表达量最高,3种多胺含量均高于野生型;在转CpSAMDC的8个株系中,3号的CpSAMDC表达量最高,腐胺及精胺含量高于野生型,但亚精胺含量略低于野生型;转CpSPDS基因的拟南芥中,Spd含量显著高于野生型及转CpSAMDC基因拟南芥。