【摘 要】
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背景婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症（INCL）是一种严重的神经退行性疾病。该病由于CLN1基因突变造成棕榈酰化蛋白硫酯酶1（PPT1）缺乏,引起进行性精神运动迟缓、视力障碍和癫痫等神经功能障碍,并最终导致患者过早死亡。癫痫作为INCL的典型症状其病因尚未阐明。有研究表明小胶质细胞在癫痫患者和癫痫动物模型中被大量激活。因此,我们使用PPT1 KI小鼠模拟INCL疾病,来探讨PPT1 KI小鼠是否存在癫痫
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背景婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症（INCL）是一种严重的神经退行性疾病。该病由于CLN1基因突变造成棕榈酰化蛋白硫酯酶1（PPT1）缺乏,引起进行性精神运动迟缓、视力障碍和癫痫等神经功能障碍,并最终导致患者过早死亡。癫痫作为INCL的典型症状其病因尚未阐明。有研究表明小胶质细胞在癫痫患者和癫痫动物模型中被大量激活。因此,我们使用PPT1 KI小鼠模拟INCL疾病,来探讨PPT1 KI小鼠是否存在癫痫活动,以及小胶质细胞活化与癫痫发作的关系。目的观察PPT1 KI小鼠是否存在明显的癫痫行为和小胶质细胞的活化,研究PPT1 KI小鼠小胶质细胞活化参与癫痫发作的途径。方法1.行为学观察:观察并统计5月龄、6月龄和7月龄的PPT1 KI小鼠以及7月龄WT小鼠24h癫痫发病的次数和时长。2.电生理场电位记录:记录7月龄的PPT1 KI小鼠及同龄WT小鼠离体脑片海马CA3区的场电位,并分别给予在200n M KA记录场电位变化情况。3.细胞标志物及炎症因子测定:使用Western blots检测1-7月龄的PPT1 KI小鼠及WT小鼠海马区Iba-1、GABAARα1、GFAP、Glu N2B和CD68表达水平。4.选择7月龄的PPT1 KI小鼠及同龄WT小鼠眉状海马处做Iba-1的免疫荧光染色和anti-Neu N的免疫组化染色,统计小胶质细胞和神经元的数目。5.ELISA试剂盒检测7月龄PPT1 KI小鼠和同龄WT小鼠海马区IL-1β和TNF-α表达水平。并检测PPT1 KI小鼠癫痫状态,非癫痫状态及WT小鼠海马区ATP浓度。6.给药实验:腹腔注射给予7月龄PPT1 KI小鼠小胶质细胞P2X7受体抑制剂A438079和0.85%生理盐水,观察并记录给药后24h中小鼠癫痫发作的次数及总时间、小胶质细胞数目及形态变化。结果1.行为学结果表明只有7月龄PPT1 KI小鼠才存在明显的癫痫行为,表现为节律性点头和前肢震颤,但也存在后肢直立和跌倒等严重的癫痫症状（PPT1KI小鼠,n=20,WT小鼠,n=3）。2.200n M KA可诱导7月龄WT小鼠出现γ振荡,在7月龄PPT1 KI小鼠可诱导出癫痫样放电（PPT1 KI小鼠,n=16,WT mice,n=17）。3.Western blots结果显示7月龄PPT1 KI小鼠海马区Iba-1表达水平明显高于同龄WT小鼠（p=0.04,置换t检验,n=6）。相较6月龄PPT1 KI小鼠,Iba-1及CD68在7月龄显著升高（Iba-1,p＜0.001,单因素ANOVA+LSD检验,n=35;CD68,p=0.03,单因素ANOVA+LSD检验,n=21）,GFAP在早期升高明显（1月龄vs 4月龄,p=0.01,单因素ANOVA+LSD检验,n=21）。GABAARα1和Glu N2B的表达趋势随年龄升高下降（GABAARα1,1月龄vs 7月龄,p＜0.01,单因素ANOVA+LSD检验,n=35;Glu N2B,1月龄vs 7月龄,单因素ANOVA+LSD检验,p＜0.01,n=35）。4.Iba-1免疫荧光结果提示7月龄PPT1 KI小鼠海马CA1和CA3区小胶质细胞数目明显高于同龄WT小鼠（CA1,p=0.003,置换t检验,n=12,CA3,p=0.005,置换t检验,n=12）且被大量活化。anti-Neu N免疫组化结果显示7月龄PPT1 KI小鼠晚期海马CA1区椎体神经元数目明显降低（5月龄vs 7月龄,p＜0.001,单因素ANOVA+LSD检验,7月龄PPT1 KI小鼠vs 7月龄WT小鼠,p＜0.001,标准t检验,n=12）。5.ELISA结果显示7月龄PPT1 KI小鼠海马TNF-α浓度则显著升高（WT vs PPT1 KI,P=0.02,置换t检验,n=10）。癫痫状态下PPT1 KI小鼠海马区ATP浓度显著高于非癫痫状态,同时非癫痫状态下ATP浓度高于WT小鼠（PPT1 KI小鼠癫痫组vs PPT1 KI小鼠非癫痫组,p=0.043,PPT1 KI小鼠非癫痫组vs WT组,p=0.048,置换t检验,n=9）。6.A 438079给药后较给药前PPT1 KI小鼠癫痫的发作时间及发作次数明显下降（发作时间,p=0.01,发作次数,p=0.01,置换t检验,n=8）,小胶质细胞数目在海马CA1及CA3区明显降低（CA1,p=0.004,CA3,p=0.02,置换t检验,n=12）。结论1.PPT1 KI小鼠在7月龄出现自发性癫痫,海马区神经元网络功能受损,出现癫痫样放电。2.通过使用P2X7受体抑制剂可减少PPT1 KI小鼠的癫痫发作及小胶质细胞活化,提示PPT1 KI小鼠晚期癫痫发作与小胶质细胞活化相关。
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