【摘 要】
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在体外胚胎培养环节,易产生过量的活性氧,过多的活性氧会使细胞发生氧化应激,引发细胞损伤和细胞凋亡,最终导致细胞死亡。本研究验证三种抗氧化剂茶多酚(TP)、乙酰左旋肉碱(ALC)和N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)组合使用,是否通过Keap1-Nrf2通路,调节下游基因表达,对H2O2诱导的小鼠体外胚胎产生抗氧化作用,并抑制细胞凋亡。将TP(5μM)、ALC(10 μM)和NAC(10 μM)最适浓度组
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在体外胚胎培养环节,易产生过量的活性氧,过多的活性氧会使细胞发生氧化应激,引发细胞损伤和细胞凋亡,最终导致细胞死亡。本研究验证三种抗氧化剂茶多酚(TP)、乙酰左旋肉碱(ALC)和N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)组合使用,是否通过Keap1-Nrf2通路,调节下游基因表达,对H2O2诱导的小鼠体外胚胎产生抗氧化作用,并抑制细胞凋亡。将TP(5μM)、ALC(10 μM)和NAC(10 μM)最适浓度组合添加到培养液,实验分为四组:对照组,抗氧化剂组,H2O2处理组,H2O2+抗氧化剂处理组。首先通过对上述四组的胚胎相关指标(如2-细胞发育率、4-细胞发育率和囊胚发育率)的观测,来验证TP、ALC和NAC三种抗氧化剂组合使用对胚胎早期发育的影响。收集四组昆明小鼠囊胚,利用DCFHDA测定上述四组小鼠胚胎囊胚期ROS水平,利用CMF2HC对上述四组小鼠胚胎囊胚期GSH表达进行测定。然后利用Western-Blot手段对小鼠囊胚期胚胎Keap1-Nrf2通路中相关蛋白Keap1及Nrf2的表达进行测定,及利用RT-qPCR对Keap1-Nrf2通路下游基因SOD1,GPX1,CAT的表达进行测定。之后利用JC-1法对囊胚期胚胎的线粒体膜电位进行测定,用TUNEL法对细胞凋亡进行检测。并且对细胞凋亡相关基因Bcl-2,Bax,Caspase-3及全能性基因OCT-4的表达进行测定。得到如下结果:(1)对于TP、ALC和NAC组合添加对氧化损伤小鼠胚胎早期发育的影响,各处理组之间卵裂率、四细胞率无显著差异,H2O2处理组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05),在培养基中添加组合抗氧化剂之后,恢复到对照组相似的水平。(2)H2O2处理组的ROS水平显著高于单独添加抗氧化剂组(P<0.05),GSH水平显著低于单独添加抗氧化剂组(P<0.05),处理组ROS水平显著低于其他组(P<0.05),GSH水平显著高于其他组(P<0.05),H2O2+抗氧化剂处理组的ROS和GSH的表达量恢复至对照组的水平。(3)TP、ALC和NAC对胚胎氧化损伤的保护作用是通过激活Keap1-Nrf2通路来产生的,经H2O2诱导的小鼠胚胎在培养基中添加组合抗氧化剂之后,细胞浆内的Keap1及Nrf2和细胞核内Nrf2的蛋白表达水平恢复至对照组的水平,下游基因SOD1,GPX1,CAT的表达同样显示出相似的趋势。(4)添加组合抗氧化剂组相比于H2O2处理组的囊胚显著增加了线粒体膜电位极性(P<0.05),降低细胞内凋亡指数(P<0.05),恢复至对照组的水平。(5)添加组合抗氧化剂之后,囊胚中的胚胎多能性相关基因OCT4的mRNA转录水平显著升高(P<0.05),抗凋亡基因Bcl-2的转录上调,促凋亡基因Bax,Caspase-3的转录下调。以上结果表明,在培养基中组合添加三种抗氧化剂(TP、ALC、NAC),会通过Keap1-Nrf2通路,调节小鼠囊胚期胚胎下游基因表达,对小鼠体外胚胎产生抗氧化作用,并抑制凋亡。
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