[目的]糖尿病认知功能障碍（diabetic cognitive impairment,DCI）是糖尿病的一种慢性并发症,其确切的发病机制目前尚不清楚。中医理论认为,DCI多由“肾虚血瘀,髓海不充”所致,课题组根据既往临床实践及实验研究,以“补肾活血,益脑健智”为法,将菟丝子、仙灵脾、女贞子、葛根和红景天五味中药组成兔仙合剂。本课题将应用网络药理学、肠道微生物多样性分析以及代谢组学的研究方法,从生物信息分析及整体和分子水平的实验开展兔仙合剂对DCI大鼠模型的作用及机制的初步探索。[方法]1.检索数据库并查阅相关文献,获取兔仙合剂中五味中药的成分组成并按口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥ 30%、类药性（drug-likeness,DL）≥ 0.18 进行筛选,再从数据库中查询所筛选成分的作用靶点及DCI的疾病靶点,联合进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析。2.将40只无特定病原体（Special pathogen free,SPF）级SD大鼠按随机数字表法分为正常组（Con组,n=10）和造模组（n=30）,造模组予高糖高脂饲料喂养6周后按照35mg/kg腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）溶液,成模后再按随机数字表法分为糖尿病模型组（DM组,n=10）、兔仙合剂组（Txm组,n=10）、安理申组（Als组,n=10）,Con组予普通饲料喂养6周后腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。成模后Txm组予兔仙合剂5g/（kg·d）灌胃,Als组予安理申0.5g/（kg·d）灌胃,Con组与DM组灌胃等量蒸馏水,每日一次,连续灌胃10周,每周测量体重,每两周检测血糖。灌胃10周后以Morris 水迷宫检测大鼠认知功能,取大鼠大脑及双侧海马组织,进行尼氏染色,Western Blot检测脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）及 γ-氨基丁酸（y-aminobutyric acid,GABA）A 受体 α1的表达。3.灌胃10周后收集大鼠粪便,提取粪便基因进行16SV3-4区测序,分析正常大鼠与DCI大鼠肠道菌群结构的差异,及予兔仙合剂干预后对DCI大鼠肠道菌群的影响。4.基于UPLC-MS/MS广泛靶向代谢组学,采用主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）及正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial least squares discriminat analysis,OPLS-DA）对不同组大鼠海马组织的代谢物进行识别,分析差异代谢物并构建KEGG通路分析。[结果]1.网络药理学分析结果兔仙合剂共有51个活性成分可作用于619个潜在靶点,其中与糖尿病相关靶点有33个,与认知功能障碍相关靶点有18个,KEGG分析结果显示兔仙合剂可能通过调节类固醇激素的生物合成、癌基因的表达、GABA能信号通路等发挥其治疗DCI的作用。2.体重与血糖灌胃前各组大鼠的体重无显著性差异（p>0.05）。灌胃后第1周,DM组与Txm组大鼠体重显著低于Con组（p<0.05）,自第2周起,各造模组大鼠体重均显著低于Con组（p<0.05）。干预后各造模组间大鼠体重无显著性差异（p>0.05）。自干预开始,各造模组大鼠血糖均显著高于Con组（p<0.05）,各造模组间大鼠血糖无显著性差异（p>0.05）。3.Morris水迷宫定位航行试验显示,潜伏期两因素重复测量方差分析结果显示,干预（F（3,18）=4.502,p=0.016）和时间（F（3,18）=8.194,p=0.001）对大鼠潜伏期均有显著影响,但两者之间没有显著的交互作用（F（9,54）=1.605,p=0.137）。测试第1天,各组大鼠潜伏期无显著差异（p>0.05）;自第2天起,DM组大鼠潜伏期显著长于Con组（p<0.05）;与DM组相比,Txm组大鼠第4天潜伏期显著缩短（p<0.05）,Als组大鼠第2天潜伏期显著缩短（p<0.05）;随着试验次数的增多,各组大鼠潜伏期均呈缩短趋势。试验中各组大鼠游泳速度无显著差异（p>0.05）。空间探索试验显示,与Con组相比,DM组大鼠穿越站台区域的次数显著减少（p<0.05）,停留在目标象限的时间显著缩短（p<0.05）;与DM组相比,Txm组和Als组大鼠穿越站台区域的次数显著增多（p<0.05）,停留在目标象限的时间显著延长（p<0.05）。4.尼氏染色Con组大鼠海马神经元排列紧密有序,DM组大鼠海马神经元排列稀疏杂乱,Txm组和Als组神经元形态介于Con组和DM组之间。通过计算CA1区20000μm2范围内海马神经元的数量,与Con组相比,造模组海马神经元的数量均显著减少（p<0.05）;与DM组相比,Txm组和Als组海马神经元数量均显著增多（p<0.05）。5.海马神经元BDNF与GABA A受体α1蛋白的表达与Con组相比,DM组BDNF蛋白表达显著降低（p<0.05）;与DM组相比,Txm组和Als组BDNF表达均显著增加（p<0.05）。与Con组相比,DM组GABA A受体α1的表达显著下调（p<0.05）;与DM组相比,Txm组和Als组GABAA受体α1的表达显著上调（p<0.05）。6.肠道菌群16SV3-4区测序分析与正常大鼠相比,造模组大鼠的Chao1指数、Observed species指数、PDwholetree指数均显著降低（p<0.05）;各造模组间三项指数无显著性差异（p>0.05）。Anosim分析结果显示,4个分组彼此两两进行比较时,R统计值均>0,对应p值均<0.05。Metastats组间显著性差异分析结果显示,与正常大鼠相比,DCI大鼠粪便中显著富集了放线菌门（Actino bacteria）、变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）等59种肠道微生物,其中有17种曾被报道与认知功能障碍相关;与DCI大鼠相比,兔仙合剂干预后大鼠粪便中显著富集了血尿杆菌（Turicibacter）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、肠球菌（Enterococcus）、马文布氏菌（Marvinbryantia）等6种肠道微生物,其中有4种微生物曾被报道与认知功能相关。7.UPLC-MS/MS广靶代谢组学分析PCA分析显示不同组海马组织样本在代谢物多样性方面存在差异。OPLS-DA分析显示,与正常大鼠相比,DCI大鼠海马组织中的差异代谢物有51个,上调39个,下调12个;与DCI大鼠相比,兔仙合剂干预后大鼠海马组织中的差异代谢物有24个,上调13个,下调11个,其中有13个代谢物发生了回调,有2个曾被报道与认知功能障碍相关（上调3-羟丁酸和下调丙二酸）。KEGG通路分析显示差异代谢物可能参与了糖脂代谢、氨基酸代谢、酮体的合成与降解及细胞铁死亡等信号通路。[结论]1.网络药理学研究提示,兔仙合剂可能通过调节类固醇激素的生物合成,癌基因的表达,GABA能信号通路等发挥其改善DCI的作用。2.DCI大鼠认知功能下降,海马神经元排列稀疏杂乱,数量显著减少,海马组织BDNF及GABA A受体α1的表达下调。DCI大鼠肠道菌群物种多样性下降,其认知功能障碍的出现与放线菌门（Actinobacteria）、变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）等17种菌群的富集有关。同时,DCI大鼠海马组织中的代谢物发生了明显的变化,胆固醇代谢、胆汁分泌、甾类激素生物合成、酮体的合成与降解等信号通路参与了这种变化。3.兔仙合剂能够提高DCI大鼠的认知能力,是通过保护海马神经元,上调BDNF及GABAA受体α1的表达,纠正DCI大鼠肠道菌群部分物种的丰度（血尿杆菌（Turicibacter）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、肠球菌（Enterococcus）、马文布氏菌（Marvinbryantia）4种菌群）,上调3-羟丁酸、下调丙二酸含量,调节糖脂代谢、氨基酸代谢、酮体的合成与降解及细胞铁死亡等多种途径实现的。[创新点]1.本课题以治疗DCI为目的,在既往临床实践及实验研究的基础上,以“补肾活血,益脑健智”为法,创立新方兔仙合剂。2.应用网络药理学、肠道微生物多样性分析以及代谢组学的研究方法,从生物信息分析及整体和分子水平的实验探索验证兔仙合剂对DCI大鼠认知功能的作用及机制。