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甘露醇是一种功能性糖醇,其性质稳定,具有较好的抗压性、抗粘性、无吸湿性等优点,在医药、食品以及化学工业等方面有着十分广泛的应用。与其他方法相比,生物转化法合成甘露醇具有反应条件温和、副产物少且产物收率高等优点,因此被广泛研究。本论文针对大肠杆菌K-12中甘露醇合成和分解途径及其关键酶进行了研究,构建了以不同底物合成甘露醇途径中关键酶的表达菌株,并对其表达情况和转化条件进行了探究;敲除了甘露醇的分解途径,并对改造后菌株的生长及对甘露醇的利用情况进行了分析。首先,研究了以葡萄糖为底物合成甘露醇的关键酶和途径。构建了重组菌株BL21(DE3)/pET28a-mtlD-mlp,经 SDS-PAGE 分析可知,MTLD 表达量较高,M1 Pase的表达量很低;加入葡萄糖进行转化后的发酵液中,未检测到甘露醇。其次,研究了以果糖为底物合成甘露醇的途径和关键酶。构建了重组菌株BL21/pET28a-mdh(NADH)、BL21/pET28a-mdh(NADPH),测得纯化后的 NADPH 依赖型甘露醇脱氢酶(MDH-1)的酶活为270 U/mL,酶转化果糖生成甘露醇的最佳条件是:当底物浓度为300 g/L,反应初始pH 5.8,温度40℃,NADPH终浓度为9 mM时,甘露醇转化率可以达到97.4%;测得纯化后的NADH依赖型甘露醇脱氢酶(MDH-2)的酶活为173 U/mL,对酶转化果糖生成甘露醇的条件进行了优化,得到转化的最佳条件是:当底物浓度为300 g/L,反应初始pH 5.3,温度30℃,NADH终浓度为7.5 mM时,甘露醇转化率可以达到92.3%。然后,阻断了E.coli K-12中甘露醇的分解途径。通过敲除E.coli PTS系统中的cmtA、cmtB、mtlA 基因,获得了突变菌株 K-1 2(ΔcmtAΔcmtB)和K-1 2(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)。测定了两株突变菌株的生长以及对甘露醇利用能力的变化,与出发菌株K-12相比,K-12(ΔcmtAΔcmtB)的生长速率没有降低,而K-1 2(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)的生长速率明显下降。分别以葡萄糖、甘露醇以及二者混合作为唯一碳源培养两株突变菌株及出发菌株,测定生长曲线,可知:K-12(ΔcmtAΔcmtB)的生长速率较K-12下降明显,而K-12(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)已无法生长,说明cwtA、cmtB、mtlA三个基因全部敲除后,菌株已无法再利用甘露醇作为碳源生长。最后,构建了重组菌株K-1 2(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)/pTrc99a-mdh,测得纯化后的MDH-1酶活力为258 U/mL,用细胞破碎液对果糖进行转化,得到甘露醇的转化率为3.6%,为进一步构建高效合成甘露醇的大肠杆菌合成菌株奠定了基础。