T细胞活化需要双信号:第一信号是TCR(T cell receptor)识别抗原提呈细胞表面抗原肽-MHC复合物,第二信号是T细胞和抗原提呈细胞共刺激分子之间的互相作用,共同决定T细胞的活化增殖,维持并调节活化级联反应,抑或转变为无反应状态甚至凋亡。正性共刺激分子ICOS(inducible costimulator)与其配体ICOSL(inducible costimulator ligand)相互作用后能有效地促进T细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌等,还会参与Tfh(T follicular helper cells)增殖分化和生发中心反应,从而对B细胞分泌抗体发挥作用。同时ICOS/ICOSL信号通路在自身免疫性疾病、移植免疫、肿瘤免疫乃至感染性免疫的发生发展过程中具有重要的生物学功能。正性共刺激分子ICOSL以两种形式存在:可溶型和膜型。膜型ICOSL分子一定程度表达在活化的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和部分T细胞亚群,也可诱导表达于血管内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞上。ICOSL与其表达在T细胞上的受体ICOS结合,可以不依赖于B7/CD28通路作用于T细胞发挥功能。ICOS分子胞内段含有一个“YMFM”基序,可与PI3K结合发挥其激酶活性,作用于下游信号通路,即ICOS/ICOSL信号途径会激活T细胞内依赖PI3K的信号途径。一般情况下可溶性共刺激分子可以通过专一的mRNA编码经免疫细胞直接分泌产生,也可以由膜型分子经蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶等)的裂解而形成。临床资料分析显示,部分可溶性共刺激分子具有临床诊断的价值,然而机体中是否存在可溶性ICOSL,它是通过何种机制产生的,表达特性如何,在对膜型ICOS/ICOSL的调节作用中扮演何种角色,在临床疾病的免疫病理中发挥何种生物学作用等,这些问题还有待研究。因此,ICOS/ICOSL信号通路对T细胞在免疫应答中的调节发挥重要的生物学作用。通过研究ICOS/ICOSL的表达及其介导的信号通路与临床疾病的关系,阐明其在免疫病理中的作用和机理,可以为某些疾病的免疫诊断和免疫治疗寻求新的途径。本课题研究旨在构建转基因细胞L929/ICOSL的基础上,研制出特异性的鼠抗人ICOSL单克隆抗体,同时分析其生物学特性,进一步探究单抗对ICOS/ICOSL途径的调节作用和对T细胞增殖及其细胞因子分泌的影响;并应用所得单抗研制特异性检测人可溶性icosl(sicosl)的elisa试剂盒,对试剂盒的精确性和稳定性进行评价;利用研制的elisa试剂盒检测健康志愿者和系统性红斑狼疮患者外周血可溶性icosl的表达水平,探究sicosl可能的产生机制,进而探讨该可溶性因子在系统性红斑狼疮免疫病理中的临床意义。上述研究结果为阐明膜型icosl和可溶型icosl的生物学意义及icos/icosl在自身免疫性疾病中的作用提供了新的线索。一、鼠抗人icosl单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究【目的】研制特异性鼠抗人icosl单克隆抗体,为探究人icosl分子在不同细胞上或多种疾病中的表达奠定物质基础,并为探讨icos/icosl信号通路的生物学意义提供物质材料。【方法】以高表达人icosl分子的转基因细胞l929/icosl免疫balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术将骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾脏细胞进行融合,运用流式细胞术对杂交瘤细胞的培养上清进行初筛,将合格的杂交瘤细胞株反复检测和亚克隆,成功获得两株特异性好且能够持续稳定分泌鼠抗人icosl单抗的杂交瘤细胞株;采取cba法和快速定性试纸法鉴定抗体亚型;通过westernblot、dotblot、细胞免疫荧光技术和elisa以及两株单抗之间或单抗与蛋白之间的竞争结合抑制实验分析所得单抗的生物学特性;用流式细胞术和间接免疫荧光分析icosl在多种肿瘤细胞表面的表达水平;研究所得单抗在人t细胞体外增殖实验中的生物学功能。【结果】1、成功获得两株稳定分泌特异性鼠抗人icosl单克隆抗体的杂交瘤细胞株:13d11和20b10。这两株单抗可用于流式细胞术、westernblot、dotblot、elisa、细胞免疫荧光技术的检测分析;2、竞争抑制实验表明,两株单抗识别icosl分子不同的抗原表位,且都与商品化单抗2d3不同;两株单抗均能有效阻断icos/icosl的结合;3、t细胞体外增殖实验结果表明,单克隆抗体13d11可抑制活化t细胞的体外增殖,且其抑制作用随单抗浓度的增加而增强。【结论】成功获得两株特异性鼠抗人icosl单克隆抗体,两者识别icosl不同的抗原表位,为研制检测人可溶性icosl的elisa试剂盒,进一步用来测定可溶性icosl的表达水平奠定了良好的物质基础;也为分析膜型icosl的表达特性,探讨icos/icosl信号通路对免疫系统的调节及其生物学功能提供必要的物质材料。二、特异性检测人可溶性icosl蛋白elisa试剂盒的研制【目的】研制稳定灵敏的特异性检测人sicosl的elisa试剂盒,为定量分析临床来源的标本和研究可溶性icosl的生物学意义提供有潜在应用价值的检测试剂。【方法】运用anti-icoslmab(20b10)作为包被抗体,在包被液(即碳酸盐缓冲液)中包被elisa板,4℃避光过夜,biotin-anti-icoslmab(2b4)作为检测抗体,识别已与20b10相结合的抗原,再加入streptavidin-hrp反应,最后用tmb底物显色,即双抗体夹心法建立sicosl的elisa检测体系。利用同一次实验多孔检测的方法分析试剂盒的精确性,利用同一次实验elisa板的不同测定时间的准确性分析试剂盒稳定性。【结果】建立稳定、灵敏的特异性检测人sicosl的elisa试剂盒,且试剂盒能特异性测定人sicosl,而不识别其他蛋白,试剂盒的标准曲线在sicosl蛋白0.156~10ng/ml的范围内表现出良好的线性关系。这种方法有良好的精确性和稳定性,离散度(cv%)分别为<10.9%和<3.65%。【结论】研制出特异性检测人sicosl的elisa试剂盒,为定量分析可溶性icosl的生物学功能和临床价值提供了有效的检测手段。三、可溶性icosl的表达特性及其在系统性红斑狼疮中的临床意义【目的】检测健康人外周血中sicosl的表达水平,揭示机体sicosl的产生机制,探讨sicosl在系统性红斑狼疮(sle)患者外周血异常表达的临床意义。【方法】应用第二部分研制的特异性检测人sicosl的elisa试剂盒分析各年龄层健康志愿者外周血中sicosl的表达特性;在高表达可溶性icosl的l929/icosl细胞培养液中加入金属蛋白酶抑制剂(mmpi),设空白对照,在不同时间点分析sicosl的表达水平;人淋巴细胞分离液(ficoll)加磁珠分选获得cd14+单核细胞和cd19+b细胞,加入mmpi,同时设空白对照,体外刺激活化后,运用elisa和流式检测可溶型和膜型icosl的表达水平,elisa检测培养上清中可溶性mmp-2和mmp-9的表达水平。流式检测45例系统性红斑狼疮患者和39例健康志愿者(healthycontrol,hc)外周血cd4+、cd8+t细胞表面icos及cd14+单核细胞、cd19+b细胞表面icosl的表达特性;利用自主研制的sicoslelisa试剂盒分析血浆可溶性icosl的表达。用统计学软件将测得的数据与临床各项指标作相关性分析,评价其临床意义。【结果】1、elisa检测结果显示,sicosl存在于人外周血中,且表达水平与年龄、性别有一定的相关性;2、基质金属蛋白酶抑制剂(mmpi)能抑制l929/icosl转基因细胞或过度活化的cd14+单核细胞和cd19+b细胞培养上清中sicosl的表达,且与对照组相比,实验组mmp-2和mmp-9的表达下调;3、与健康对照(hc)相比,sle患者外周血cd4+、cd8+t细胞表面icos的表达均显著升高(19.07±1.74)%vs(13.99±1.54)%、(10.04±0.99)%vs(6.36±0.99)%,且差异有统计学意义(p<0.05),cd14+单核细胞上icosl的表达高于健康对照[(2.94±0.88)%vs(0.89±0.21)%,(p=0.04)],且与患者血浆c3和c4水平呈正相关[(r=0.40,p=0.031),(r=0.44,p=0.017)]。活动期组sle患者血浆sicosl的浓度显著高于非活动期组[(361.5±25.28)(ng/ml)vs(278±14.75)(ng/ml),(p=0.025)],且与cd14+单核细胞和cd19+b细胞表面icosl的表达均呈负相关[(r=-0.4243,p=0.022)、(r=-0.4099,p=0.025)]。【结论】人外周血中存在可溶性icosl,且mmp是其可能的产生机制之一。sle患者外周血淋巴细胞表面icos和icosl以及血浆sicosl表达水平显著增加,且与疾病活动度密切相关。提示icos/icosl途径可能参与sle免疫病理过程。综上所述,本研究获得以下结果:(1)研制出2株鼠抗人icosl单克隆抗体,可用于流式细胞术、westernblot、dotblot和elisa等研究;功能性鼠抗人icosl单抗13d11能抑制icos/icosl介导的t细胞增殖及细胞因子的分泌。(2)建立了特异性检测人sicosl的elisa方法,而且这个方法具有良好的精确性和稳定性。(3)利用研制的sicoslelisa试剂盒分析表明,健康人外周血中存在sicosl,且金属蛋白酶(MMPs)剪切机制是s ICOSL的产生机制之一;SLE患者外周血淋巴细胞表面ICOS和ICOSL及血浆sICOSL均表达异常,并且与疾病活动度密切相关,表明ICOS/ICOSL途径可能参与SLE免疫病理进程。