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糖尿病常常导致骨质疏松症的发生,并加速其进展。1型糖尿病(type1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)影响骨密度(bone mineral density,BMD)与骨质量,并增加骨折风险。越来越多的证据表明T2DM与骨质疏松症可能具有共同的遗传倾向和病生理分子基础。由于两者之间的相关性,降糖药对骨代谢的影响引起越来越多的关注。胰高糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂(GLP-1 receptor agonists,GLP-1RAs)是一种新型且有潜力的2型糖尿病药物,目前研究认为,其在骨组织相关疾病中发挥重要作用。GLP-1由肠道L细胞受食物摄入刺激而合成并分泌,葡萄糖浓度依赖性的刺激胰岛β细胞释放胰岛素,抑制α细胞分泌胰高血糖素。除降糖作用外,GLP-1通过影响迷走神经传入纤维和下丘脑,延缓胃排空并抑制食欲,减轻体重。GLP-1通过GLP-1受体调控体内葡萄糖平衡。然而,天然GLP-1在循环中被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)迅速降解。与人GLP-1结构具有97%同源性的合成GLP-1RA利拉鲁肽,能抵抗DPP-IV的失活,并且具有更长的半衰期,从而使其成为适用于每日注射一次的新型降糖药物。除了在治疗糖尿病和肥胖中的重要价值,GLP-1受体在胰腺β-细胞和α-细胞外的多种组织的表达,激起了人们极大的兴趣去探索GLP-1RAs的心血管、神经、肾脏保护功能和其他胰腺外的积极作用。体外研究表明成骨细胞表达GLP-1的功能性受体。因此,骨也可能是GLP-1RAs的潜在靶器官。据报道胰高血糖素样肽-1(GLP-1)可以提高骨密度,改善骨质量,GLP-1和骨折的关系仍在研究中。GLP-1促进骨形成抑制骨吸收,但具体过程及相关分子机制仍不明确。成骨细胞是在维持骨稳态中起关键作用的间充质细胞,负责细胞外基质蛋白的产生,调节基质矿化,调控骨重塑,并调节破骨细胞分化。成骨细胞与许多骨疾病的发病机理有关,尤其在骨质疏松的发生发展中具有重要价值。几十年来,骨质疏松症主要治疗都是以抑制破骨细胞成熟、增殖和活性为主;但近年来成骨细胞的分化或活性异常导致骨代谢异常及相关疾病越来越受到人们的重视。成骨细胞的功能和数目维持已成为目前骨质疏松症治疗的研究重点。鉴于2型糖尿病和骨质疏松症之间的密切关系,本研究主要通过利拉鲁肽对体外前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和凋亡的影响,深入探讨利拉鲁肽调控成骨细胞骨形成能力的分子机制,为临床糖尿病骨质疏松患者的治疗提供新的药物靶点和策略。第一部分利拉鲁肽促进MC3T3-E1细胞增殖和分化目的:观察不同浓度利拉鲁肽在不同时间点对小鼠前成骨MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响,并证实GLP-1R在MC3T3-E1细胞中的表达。方法:1以不同浓度的利拉鲁肽(0,10,100,500,1000n M)刺激体外培养的小鼠前成骨MC3T3-E1细胞,并分别在细胞接种后的第24、48和72h应用MTT法对细胞进行活性检测以评估成骨细胞的增殖能力。2应用50mg/L抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠诱导小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞分化,分别给予不同浓度的利拉鲁肽(0,10,100,500,1000nM)进行处理,并分别在0、7、14、21、和28天收集细胞,利用荧光定量PCR对成骨细胞特定的分化标志物collagen-1(COL1),osteocalcin(OC),runt-related transcription factor-2(RUNX2)and osteoprotegerin(OPG)的mRNA水平进行检测;用比色法对0,7,14天MC3T3-E1细胞进行成骨分化早期指标碱性磷酸酶(ALP)活性检测;用茜素红染色观察细胞矿化诱导21天后的细胞外基质矿化结节并计算其相对吸光度。3利用RT-PCR和Western blot分析,以小鼠胰腺组织为阳性对照,对小鼠MC3T3-E1细胞中GLP-1R的mRNA和蛋白水平进行检测;采用激光显微共聚焦技术对MC3T3-E1细胞中GLP-1R蛋白的表达进行定位与定性分析;利用RT-PCR和Western blot技术分析0、7、14、21、和28天诱导分化的MC3T3-E1细胞中GLP-1R的mRNA和蛋白水平,明确GLP-1R表达在成骨细胞分化过程中的变化趋势。结果:1.利拉鲁肽增加成小鼠前成骨MC3T3-E1细胞生物活性,在中间时间(48h)和浓度(100nM)达到峰值。2.成骨细胞分化因子COL1,OC,RUNX2,OPG的mRNA及ALP活性变化趋势表明MC3T3-E1细胞经历特定的成骨分化成熟过程。利拉鲁肽显著增强COL1,OC,RUNX2,OPG的mRNA表达,COL1和OPG在14天,OC和Runx2第21天增加最明显。肉眼观察茜素红染色及氯化十六烷吡啶半定量成骨细胞钙沉积,表明利拉鲁肽促进MC3T3-E1细胞矿化。3.GLP-1R存在于MC3T3-E1细胞。RT-PCR结果显示在111 bp处呈现GLP-1R特定条带。Western blot分析和激光共聚焦进一步证实这一结果。此外利拉鲁肽在MC3T3-E1细胞分化期间增加GLP-1R mRNA和蛋白表达,并在21天达最高值。第二部分利拉鲁肽通过GLP-1R激活PI3K/Akt、ERK1/2和cAMP/PKA信号通路与β-catenin交联促进MC3T3-E1细胞增殖和分化目的:研究利拉鲁肽调控小鼠前成骨MC3T3-E1细胞增殖、分化的具体分子信号通路机制。方法:1应用Western blot分析测定信号蛋白Akt,ERK1/2和β-catenin各时间点(0-60min)的磷酸化水平;利用ELISA法检测cAMP的激活情况;采用Western blot法对MC3T3-E1细胞质和细胞核β-catenin蛋白水平进行检测;用实时荧光定量PCR分析TCF7L2的转录水平,明确利拉鲁肽对PI3K/Akt、ERK1/2和cAMP/PKA信号通路的激活情况。2应用PI3K信号抑制剂LY294002,ERK抑制剂PD98059,PKA抑制剂H89,进行信号通路挽救试验;利用PKA抑制剂H89验证PKA激活对β-catenin蛋白磷酸化的影响;同时利用三种抑制剂验证PI3K/Akt、ERK1/2和cAMP/PKA信号通路激活对细胞质和细胞核β-catenin蛋白水平进行检测及TCF7L2的转录水平影响,明确Wnt信号通路激活情况。3利用小干扰RNA(small interfering RNA,Si RNA)转染沉默GLP-1R和β-catenin。检测沉默GLP-1R对Akt,ERK1/2和β-catenin蛋白磷酸化及细胞内cAMP水平影响,对细胞质和细胞核β-catenin蛋白水平及TCF7L2的转录水平影响;检测沉默β-catenin对细胞质和细胞核β-catenin蛋白水平及TCF7L2的转录水平影。4检测信号通路抑制剂和小干扰RNA对MC3T3-E1细胞生物活性、细胞分化各阶段关键分子标志物、矿化的影响。结果:1.利拉鲁肽上调Akt和ERK1/2磷酸化水平,Akt和ERK1/2的磷酸效应被特异性抑制剂LY294002和PD98059所抵消。ELISA显示利拉鲁肽增加cAMP含量的最佳浓度为100 nM,且cAMP在30分钟达最大值。利拉鲁肽激活cAMP的同时,增强β-catenin在C-末端ser675位点的磷酸化,30分钟达峰值,而H89减弱β-catenin在C-末端ser675位点磷酸化,表明cAMP/PKA/β-catenin-ser675信号级联反应参与此过程。2.小干扰RNA沉默GLP-1R,利拉鲁肽诱导的cAMP/PKA/β-catenin-ser675、PI3K/Akt和ERK1/2的活化水平明显减弱,表明利拉鲁肽通过GLP-1R调控下游信号通路。利拉鲁肽增加胞质中β-catenin的含量和增强β-catenin的核易位并上调TCF7L2表达。PKA抑制剂H89和siGLP-1R下调β-catenin的核定位与TCF7L2表达水平。此外,LY294002和PD98059部分抑制β-catenin在细胞质和细胞核内聚集和TCF7L2转录,表明PI3K/AkT和ERK1/2可能与β-catenin存在交互作用从而激活Wnt信号。3.抑制剂PD98059对MC3T3-E1细胞活力减弱最明显,LY294002最小,H89居中。成骨细胞分化标志物mRNA表达水平在加入抑制剂后,明显低于空白组。PD98059和LY294002对Runx2抑制最明显,H89抑制OC最明显。小干扰RNA对GLP-1R和β-catenin的沉默,抵消利拉鲁肽对细胞活力、碱性磷酸酶活性、成骨细胞中分化成熟标志物和矿化的促进作用。第三部分利拉鲁肽通过cAMP/PKA/β-catenin和PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制血清剥夺诱导的MC3T3-E1细胞凋亡目的:研究利拉鲁肽对成骨细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行深入探讨。方法:1 RT-PCR、Western blot法和激光显微共聚焦检测GLP-1R在小鼠成骨细胞MC3T3-E1的表达。2利用不同浓度的利拉鲁肽(0,10,100,1000nM)刺激小鼠成骨细胞MC3T3-E1,分别以Hoechst 33258染色、流式细胞分析和ELISA法检测MC3T3-E1细胞凋亡情况。Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达。3利拉鲁肽刺激MC3T3-E1细胞,利用Western blot法检测Akt、β-catenin蛋白磷酸化及p-GSK3β的表达,同时采用Western blot法对MC3T3-E1细胞质和细胞核β-catenin蛋白水平进行检测,用实时荧光定量PCR分析TCF7L2的转录水平。应用PI3K抑制剂LY294002及PKA抑制剂H89联合小干扰RNA阻断GLP-1R及β-catenin表达,研究利拉鲁肽抑制MC3T3-E1细胞凋亡的分子信号机制。结果:1.利拉鲁肽非剂量依赖性抑制无血清诱导的MC3T3-E1细胞凋亡,促进Bcl-2蛋白表达,抑制Bax以及caspase-3蛋白表达。2.100 nM利拉鲁肽诱导Akt磷酸化,并升高细胞内cAMP水平。同时,Akt磷酸化被抑制剂LY294002阻断。利拉鲁肽可显著增强胞浆β-catenin在ser-675位点的磷酸化,并降低与Akt磷酸化相关磷酸糖原合成酶激酶3β磷酸化,同时伴有胞浆和细胞核β-catenin增多和TCF7L2mRNA表达上调。这些影响分别被PKA抑制剂H89和PI3K抑制剂LY294002消除。此外,siRNA阻断GLP-1R抑制细胞内cAMP活性及Akt和β-catenin磷酸化。这些结果表明,利拉鲁肽通过GLP-1R介导的cAMP/PKA和PI3K/Akt信号转导通路抑制MC3T3-E1细胞凋亡。3.特定的信号抑制剂LY294002和H89,小干扰RNA阻断GLP-1R及β-catenin及小干扰RNA,能消除利拉鲁肽无血清诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的抑制作用。结论:1.利拉鲁肽促进小鼠前成骨MC3T3-E1细胞增殖、分化,且GLP-1R表达于MC3T3-E1细胞。2.利拉鲁肽通过PI3K/Akt、ERK1/2和cAMP/PKA信号通路与β-catenin的交联激活Wnt信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖和分化,此过程受GLP-1R调控。3.利拉鲁肽通过cAMP/PKA/β-catenin和PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制血清剥夺诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。