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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引发的消化道传染病,新生仔猪致死率极高,目前PED已经对全球范围的养猪业造成了严重的经济损失。由于PEDV与宿主的相互作用及发病机制尚未研究清楚,因此PED的防治还存在很大问题。E蛋白是PEDV最小的结构蛋白,在病毒囊膜上表达量也较低。已经有研究指出多数冠状病毒的E蛋白能自组装形成五聚体,且具有离子通道(Ion channel,IC)活性,但是PEDV E蛋白是否也有相同特征还未见报道。PEDV E蛋白在内质网-高尔基体中间室(ER-Golgi intermediate compartment,ERGIC)参与病毒组装,并参与病毒胞内运输及释放过程,与PED致病也有关,但具体机制尚不清楚。在宿主细胞中研究鉴定与PEDV E蛋白相互作用的蛋白对进一步探究E蛋白的功能及PEDV释放过程有重要意义。为了研究E蛋白在PEDV致病过程中的作用,本课题首先克隆PEDV E基因,并分别与三种标签(His、MBP、eGFP)融合后连接到真核表达载体pcDNA3上,测序表明,所克隆的PEDV CV777株的E基因与原始毒株的E基因相比存在7个碱基的突变及2个氨基酸的突变。通过E基因及蛋白序列同源性分析发现,该毒株和SQ2014株、JS2008株同源性更高,基因水平分别为99.1%、98.7%,蛋白水平分别为97.4%、96.1%。通过对其他冠状病毒的E蛋白氨基酸序列保守性分析及跨膜区预测,推测本实验所用PEDV E蛋白也可能形成五聚体结构。重组质粒转染病毒宿主细胞PK-15,提取总蛋白进行Western Boltting检测发现,只有MBP-E融合蛋白能在PK-15细胞中表达,且在预期大小位置及其两倍大小的位置检测到特异性条带。为了获得大量真核表达的E蛋白,进一步利用重组慢病毒分别构建了稳定表达MBP/MBP-E蛋白的细胞株,利用MBP-Pull Down实验纯化目的蛋白,Western Boltting结果表明,纯化的蛋白主要存在于洗脱前的Amylose Resin上,且MBP-E样品在预期大小位置及其两倍、五倍大小位置检测到特异性条带,进一步证明E蛋白可能以五聚体形式存在;银染结果表明,与MBP样品相比,MBP-E样品存在差异条带。对质谱结果进行分析,鉴定得到PEDV E蛋白的42个相互作用蛋白。鉴于PEDV E蛋白在ERGIC参与病毒组装,且和病毒胞内运输及释放过程有关,因此在差异蛋白中选择了参与胞内运输的蛋白(MYH9、SEC22B及Jup蛋白)、定位于内质网(Endoplasmic reticulum,ER)的分子伴侣(HSPA5、CANX蛋白)和一个14-3-3蛋白(YWHAB蛋白),进行RNA干扰(RNA interference,RNAi),利用shRNA慢病毒构建细胞株,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)结果表明,除了HSPA5基因没有达到基因沉默的目的,其余基因表达量均显著降低。然后将PEDV接种干扰成功的细胞株(MYH9、SEC22B、Jup、CANX及YWHAB),分别于12 h和24 h收集细胞及上清,通过绝对荧光定量PCR检测上清中的病毒拷贝数,并用细胞内β-actin基因校准。绝对荧光定量PCR结果表明,与阴性对照相比,干扰后的细胞株上清中病毒拷贝数均明显降低,表明胞内运输、内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)及14-3-3蛋白家族可能参与病毒的释放过程。本课题首次在PK-15细胞中鉴定了与PEDV E蛋白互作的蛋白,并研究了互作蛋白中参与胞内运输、ERS的蛋白及14-3-3蛋白家族对病毒释放的影响,为进一步研究PEDV E蛋白的结构功能、病毒的释放过程提供理论基础,最终为PED防治提供新思路。