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阿加曲班原研厂家是日本三菱制药株式会社,是一种新型凝血酶抑制剂,可逆地与凝血酶活性位点结合,可用于缺血性脑梗死急性期病人的抗凝治疗。除了日本药典外,其它各国药典均未收载阿加曲班质量标准。根据日本药典第16版,阿加曲班杂质采用两种方法控制,分别是有关物质1和有关物质2。有关物质1通过高效液相色谱法控制,限度控制在0.10%以下；有关物质2采用TLC方法控制,该方法是限度检查法,只能控制杂质到0.3%以下。根据IMPURITIES IN NEW DRUG SUBSTANCES Q3A(R2)的要求,如果杂质限度在0.10%以上,需要提供足够的安全性数据,因此为了保证药品安全,通常杂质限度控制在0.10%以下。本文的目的是开发一种定量分析方法,将阿加曲班有关物质2的杂质限度控制在0.10%以下。由于市场上无法购买到分析方法开发用的有关物质2对照品,通过定向合成手段合成了阿加曲班杂质F和杂质G。通过高效液相色谱法、核磁共振法(NMR)和质谱法(MS),证实了阿加曲班杂质F和杂质G的结构与文献报道一致。为下一步的分析方法开发提供了对照品。本文首先研究了正相色谱法。使用Waters e2695高效液相色谱仪,Waters sunfire TM prep silica4.6×250mm,5um色谱柱,正己烷：乙醇：三氟乙酸：二乙胺=80：20：0.1：0.1为流动相,流速1.0ml/min,检测波长254nm,柱温35℃,进样量20μ1。该方法中杂质F、杂质G、阿加曲班依次出峰,杂质G和阿加曲班的分离度>1.5,理论板数按阿加曲班峰计≥3000,杂质F灵敏度0.04%,杂质G灵敏度0.10%。杂质G的灵敏度不是太理想。本文又研究开发了反相色谱法。使用安捷伦1261高效液相色谱仪,YMC J’sphere ODS-H80柱,250*4.6mm,4μm色谱柱,流动相A：1%醋酸水溶液(用氨试液调节pH至4.0,加1.0mL甲醇以防止细菌生长),流动相B：乙腈,流动相A：流动相B=70：30等度洗脱,流速1.5ml/min,检测波长254nm,柱温40℃,进样量50μ1。该方法中杂质G、阿加曲班、杂质F(杂质F含两个非对映异构体imp F-d1与imp F-d2,出双峰)依次出峰,杂质G和阿加曲班的分离度>1.0,杂质F灵敏度0.020%,杂质G灵敏度0.020%。经比较选择反相HPLC法控制有关物质2,控制限度确定为0.10%以下,可以减少临床使用风险。为了证明反相HPLC法的可行性,对该方法进行了全面的验证。主要验证项目包括专属性试验、定量限、溶液稳定性、精密度、耐用性、线性和相对响应因子、准确度。杂质F/G和阿加曲班定量限度分别为0.02%、0.02%和0.02%,阿加曲班有关物质重复性好,杂质F和G的中间精密度分别是6.5%和9.2%,达到要求,阿加曲班杂质F和杂质G以及阿加曲班相关系数R均大于0.99,该方法线性良好,阿加曲班杂质F相对响应因子为0.57,杂质G相对响应因子为1.31,均需要参与计算,杂质F和杂质G的回收率在70%以上,方法准确度均较好。综上所述,本文开发了反相HPLC法,替代日本药典的TLC方法,通过验证确认本方法适用于阿加曲班有关物质2的控制,控制限度为0.10%以下。