超细铂纳米酶的制备、稳定性及葡萄糖检测性能研究

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贵金属铂纳米粒子具有良好的类似过氧化物酶的活性,可用于多种含葡萄糖样品的检测。但铂纳米酶的分散能力、粒径大小会严重影响其催化活性,特别是对含蛋白质分子的复杂介质中葡萄糖浓度的检测。因此,制备高分散性、粒径细小的水溶性高分子稳定的铂纳米酶并用于复杂介质中葡萄糖浓度的检测就具有十分重要的意义。本文从绿色化学和提高铂纳米酶在蛋白质溶液中稳定性的角度出发,重点研究了水溶性天然多糖(银杏叶多糖、何首乌多糖和龙眼多糖)稳定铂纳米酶的水溶液稳定性、催化活性、蛋白质溶液稳定性、细胞毒性和葡萄糖检测能力,初步验证了人类血糖检测性能,并进一步通过对树状大分子的表面改性,获得了具有良好葡萄糖检测效果和高灵敏检测限的球形两性离子化树状大分子稳定铂纳米酶,实现了纳米酶对含蛋白质分子中样品的准确检测。主要内容和结论如下:(1)采用线型聚乙烯亚胺分子为模板,通过硼氢化钠还原制备了粒径范围为3.21-3.70 nm的铂纳米粒子(Ptn-PEI NPs);其水动力学粒径7天内没有明显变化并催化3,3?,5,5?-四甲基联苯胺(TMB)明显变蓝;催化动力学过程符合Michaelis-Menten方程;用比色检测醋酸-醋酸钠缓冲液中葡萄糖浓度检测限为4.2μM。Pt50-PEI NPs催化TMB的活性较低,会诱导纤维蛋白原生成沉淀和细胞死亡,导致其无法检测血浆中血糖浓度,从而发现血糖检测过程中要考虑到纳米酶的生物相容性。(2)针对Pt50-PEI NPs表现出的生物相容性低的问题,选用良好生物相容性的银杏叶多糖为载体,制备了粒径为1.08±0.16 nm银杏叶多糖负载的铂纳米粒子(Pt-GBLP NPs)。Pt-GBLP NPs使TMB明显变蓝,它的水动力学粒径7天内没有明显变化,催化动力学过程遵循乒乓机制。基于Pt-GBLP NPs比色检测醋酸-醋酸钠缓冲液中葡萄糖的线性范围为1-1000μM,检测限为0.5μM。500μg/mL Pt-GBLP NPs对HeLa细胞没有表现出细胞毒性,但诱导了纤维蛋白原生成明显聚集,造成检测血糖浓度的准确性仅为90-91%。(3)为解决Pt-GBLP NPs诱导纤维蛋白原明显聚集的问题,从提高葡萄糖单元含量的角度制备了何首乌多糖和龙眼多糖负载的1.05-1.48 nm铂纳米粒子(Ptn-PMTP NPs和Pt-LP NPs)。它们的水动力学粒径7天内没有明显变化并表现出明显的类似过氧化物酶的活性。Pt20-PMTP NPs和Pt-LP NPs检测醋酸-醋酸钠缓冲液中葡萄糖浓度的线性范围均为1-1000μM,检测限分别为0.2μM和0.35μM。500μg/mL样品对HeLa细胞几乎没有细胞毒性,却在纤维蛋白原溶液中长时间有较弱的聚集,导致此方法检测出的血糖浓度的准确率为95%。(4)为了进一步提高纳米酶在纤维蛋白原中的稳定性,通过马来酸酐、EK-5和巯基乙胺修饰五代聚酰胺-胺树状大分子制备了两性离子化树状大分子(G5MEKnC)。硼氢化钠还原法制备的铂纳米酶(Pt55-G5MEK50C)有1.40 nm的超细粒径和类似过氧化物酶的活性。Pt55-G5MEK50C能够检测线性范围1-2000μM的葡萄糖,检测限为0.1μM,是本工作中获得的最低的检测限数值,此数值同已有相关文献相比也是低的。样品的HeLa细胞活性大于90%且样品在4天内有蛋白质稳定性。初步的人体血糖试验表明:同医用全自动生化分析仪的检测结果相比,本章检测血糖含量方法的准确率为98%。Pt55-G5MEK50C催化机理是通过催化过氧化氢分解生成羟基自由基加速了TMB的氧化。
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