【摘 要】
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精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是哺乳动物成体睾丸生精上皮内唯一可复制的多能性二倍体细胞,其持续、高产的精子发生进程使其成为体外操作的理想宿主干细胞。对
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精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是哺乳动物成体睾丸生精上皮内唯一可复制的多能性二倍体细胞,其持续、高产的精子发生进程使其成为体外操作的理想宿主干细胞。对精原干细胞体内消除来制备外源性精原干细胞移植受体,以及精原干细胞体外分离培养、转基因、同种间或异种间移植,均在不同动物取得了相应的研究进展。为了给后续精原干细胞移植和转基因提供理论和技术基础,本实验进行了绵羊精原细胞消除和体外分离、培养实验,结果如下:1.阴囊注射白消安(剂量为7.5mg/kg体重、每3周注射一次、共注射4次)、皮下注射LHRH疫苗(剂量为200μg/只,每3周注射1次,共注射4次)、LH疫苗(剂量为5mg/只,每3周注射1次,共注射4次)的方法处理绵羊,进行绵羊精原细胞消除实验,实验表明,阴囊注射白消安可以完全消除绵羊睾丸曲细精管内精原细胞。LHRH和LH疫苗处理绵羊,可以抑制睾丸曲细精管内精子发生。2.单一酶消化法(1mg/mL胶原酶I,37℃、5%CO2、饱和湿度,1h)消化睾丸组织,得到单细胞悬液。并用percoll不连续梯度离心,可以在percoll浓度为27%~35%条带处分离到纯度较高的精原细胞(纯度为60.79%)。3.用DMEM+10%FBS、DMEM/F12+10%FBS培养基分别进行精原细胞和支持细胞共培养,培养24h后,以DMEM/F12组精原细胞所占比例高为59.81%,与DMEM组比较,差异不显著。培养72h后,以DMEM/F12组精原细胞存活比例为57.18%,与DMEM组比较,差异显著(P<0.05)。经过一周的培养,精原细胞在支持细胞形成的饲养层上形成集落,集落进行AKP染色鉴定,细胞呈阳性反应,染色呈红褐色,其它细胞不着色。
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