甘蔗叶多糖的分离纯化及体外活性研究

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目的:优化甘蔗叶多糖的提取纯化工艺,获取高纯度的甘蔗叶多糖组分,并对多糖进行初步结构表征和体外活性研究。方法:(1)甘蔗叶多糖的提取、超滤纯化和初步结构表征:采用水提醇沉-超滤法获得不同分子量范围的甘蔗叶多糖SCLRP,SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K,测定其总糖、糖醛酸和蛋白质的含量;通过紫外光谱扫描(UV)、傅里叶变换红外光谱扫描(FT-IR)和刚果红试验检测它们的结构特征;采用高效液相色谱法(HPLC)测定它们的分子量分布;采用扫描电子显微镜(SEM)观测它们的超微形态特征。(2)甘蔗叶多糖SCLP100K-300K的脱色工艺研究:以脱色率和多糖保留率为指标,采用双氧水脱色法,通过单因素试验、L(9*3~4)正交试验考察双氧水百分数、脱色温度、脱色时间、p H值对甘蔗叶多糖SCLP100K-300K脱色效果的影响,并优选出最佳的脱色工艺。(3)甘蔗叶多糖SCL-HP的提取和初步结构表征:采取不同的方式对甘蔗叶进行前处理,再采用碱性过氧化氢两步法提取甘蔗叶多糖,获得SCL-HP-B、SCL-HP-TE、SCL-HP-E三个组分,测定其总糖、糖醛酸和蛋白质的含量;通过紫外光谱扫描(UV)、傅里叶变换红外光谱扫描(FT-IR)和刚果红试验检测它们的结构特征;高效液相色谱(HPLC)的方法测定它们的分子量分布;采用扫描电子显微镜观测它们的超微形态特征。(4)甘蔗叶多糖的抗氧化活性研究:考察水提醇沉法得到的甘蔗叶粗多糖SCLRP,SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K,SCL-HP-B、SCL-HP-TE、SCL-HP-E这7个组分清除DPPH自由基、清除羟基自由基、清除ABTS自由基的能力和还原力测定,比较它们抗氧化活性。(5)甘蔗叶多糖对RAW 264.7活性研究:以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为研究对象,以脂多糖(LPS)为阳性对照,采用MTS增殖检测,考察SCLRP,SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K,SCL-HP-B,SCL-HP-E,SCL-HP-TE这7种甘蔗叶多糖对它增殖作用和形态影响。结果:(1)甘蔗叶多糖的提取、超滤纯化和初步结构表征:获得甘蔗叶粗多糖SCLP-1、SCLP-2、SCLP-3,根据它们的得率和总糖含量优选出SCLRP的提取方法。SCLRP,SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K,SCLP10K-30K,SCLP3K-10K,SCLP300-3K。SCLRP和不同分子量范围的多糖SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K的含量测定结果如下:总糖含量分别为11.09%、33.69%、38.03%、8.36%;糖醛酸含量分别为3.22%、9.54%、7.85%、2.10%;蛋白质含量分别为1.83%、2.33%、4.47%、3.80%。通过UV、FT-IR扫描进一步证实多糖的特征结构。电镜扫描观测近SCLRP,SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K,SCLP10K-30K的外观,发现不同孔径滤膜得到的甘蔗叶超滤多糖组分有所区别,SCLRP表现为聚集的块状结构,块状结构棱角分明,表面附有小颗粒;SCLP>300K的絮团主要由不规则的边缘圆滑的小团组成;SCLP100K-300K在低倍镜下絮状更明显,绒状物增多;SCLP30K-100K由棒状长条构成小团,絮状物减少。通过刚果红实验发现SCLRP、SCLP>300K、SCLP100K-300K具有三股螺旋构象,SCLP30K-100K不具有三股螺旋构象。(2)甘蔗叶多糖SCLP100K-300K的脱色工艺研究:最佳脱色工艺为双氧水体积分数为1%,温度为60℃,调节p H值为11的条件下脱色2 h。在此条件下SCLP100K-300K多糖平均保留率为(89.25±3.23)%,平均脱色率为(79.99±0.51)%。(3)甘蔗叶多糖SCL-HP的提取和初步结构表征:甘蔗叶多糖SCL-HP-B、SCL-HP-TE、SCL-HP-E的总糖含量分别为46.8%、41.4%、44.8%;糖醛酸含量分别为7.04%、7.52%、7.47%;蛋白质含量分别为4.25%、3.87%、2.89%。通过UV、FT-IR确认这三个组分的多糖特征吸收和峰位,发现它们的红外图谱基本相似。通过凝胶过滤色谱测定它们的分子量分布,发现它们中的主要成分的分子量集中于>289 KDa的区段,且三者的GFC图谱的出峰时间和峰型相似。根据扫描电镜观测发现,SCL-HP-B、SCL-HP-TE、SCL-HP-E这三个组分的表面形态基本一致,均呈不规则石块状,表面呈不规则凹凸状,类似碎冰块。刚果红实验结果表明SCL-HP-B、SCL-HP-TE、SCL-HP-E均不具有三股螺旋构象。(4)甘蔗叶多糖的抗氧化活性研究:SCLRP对DPPH·自由基清除能力最高,SCL-HP-TE对羟基自由基清除能力最高,SCLP100K-300K对ABTS自由基清除能力最高。(5)甘蔗叶多糖RAW 264.7的活性研究:SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K具有激活RAW 264.7和促进细胞增殖的能力。结论:本研究采用水提醇沉-超滤纯化和碱性过氧化氢两步法得到不同的甘蔗叶多糖组分,并对它们进行初步结构表征和活性研究,结果表明超滤是一种纯化多糖的有效手段,碱性过氧化氢两步法是得到高纯度甘蔗叶多糖的有效提取方法。SCLP>300K、SCLP100K-300K、SCLP30K-100K对三种自由基的清除率的EC50均小于10 mg/m L,说明这三种多糖均具有一定的抗氧化能力。SCLP>300K,SCLP100K-300K,SCLP30K-100K具有激活RAW 264.7和促进增殖的能力。双氧水脱色法是甘蔗叶多糖的一种有效脱色方法。
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