论文部分内容阅读
第一部分GRP78与卵巢癌化疗耐药的关系【目的】研究葡萄糖调节蛋白78(GRP78)亚细胞含量与卵巢癌化疗耐药之间的关系。【方法】以一对卵巢癌配对细胞株C13K和OV2008为细胞模型,C13K细胞为卵巢癌顺铂耐药细胞株,OV2008为细胞为卵巢癌顺铂敏感细胞株。运用梯度浓度的顺铂分别处理OV2008及C13K,然后通过MTT法检测这两种细胞对顺铂的敏感性;Hoechest-33258染色法观察顺铂诱导细胞凋亡的形态学变化;AnnexinⅤ-PI双染后通过流式细胞仪检测顺铂诱导的细胞凋亡率;蛋白印迹法(Western blot)检测顺铂处理前后OV2008和C13K中GRP78蛋白的表达差异。【结果】MTT结果显示,随着顺铂浓度的升高,C13K和OV2008细胞抑制率均上升,而且C13K对顺铂敏感性明显低于OV2008细胞;流式细胞仪检测显示,在同一浓度顺铂作用下,C13K细胞的凋亡率明显低于OV2008细胞的凋亡率。Western blot检测结果显示,C13K细胞中GRP78蛋白的表达水平明显高于OV2008细胞,且经顺铂处理细胞后,OV2008细胞中GRP78的表达较处理前明显下降,而C13K细胞株中GRP78的表达未见下降。【结论】GRP78基因的表达同细胞对顺铂的敏感性呈负相关,其在一定程度上参与了卵巢癌耐药的发生。第二部分GRP78对卵巢癌细胞顺铂耐药作用机制的研究【目的】通过脂质体介导转染SiRNA和GRP78诱导剂,探讨GRP78在卵巢癌顺铂耐药中的具体作用及其机制。【方法】将公司构建的针对GRP78基因的SiRNA通过脂质体介导转染至顺铂耐药株C13K细胞中。用GRP78诱导剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)预处理顺铂敏感株OV2008细胞。经顺铂处理这些细胞后,分别用MTT法检测细胞对顺铂的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期,Western blot检测相应蛋白表达水平。【结果】转染SiRNA-GRP78后,C13K细胞中GRP78蛋白的表达较对照组明显降低。下调GRP78后,C13K细胞对顺铂的敏感性较对照组显著提高,流式细胞仪检测结果同时显示,细胞的凋亡率较对照组显著提高。Western blot检测发现P-Akt表达也随同GRP78表达下调;OV2008细胞经2-DG预处理12h小时后,GRP78蛋白表达明显升高。上调GRP78后,OV2008细胞顺铂诱导凋亡率明显降低,同时Western blot检测发现P-Akt蛋白表达较对照组明显升高;OV2008细胞先后经过P-Akt抑制剂TCN和2-DG预处理后,流式细胞仪检测发现,OV2008细胞对顺铂敏感性又可恢复,同时Western blot检测发现GRP78蛋白表达升高而P-Akt蛋白表达下降。【结论】GRP78基因同卵巢癌耐药有着密切关系,上调GRP78的表达可使OV2008细胞对顺铂敏感性下降,SiRNA-GRP78后可在一定程度上逆转C13K细胞对顺铂的耐药性,而且其机制可能通过PI3K/AKT细胞信号传导通路发挥其逆转耐药的作用。