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目的:妊娠期高血压疾病是一组严重危害母儿健康的疾病,子痫前期是其中最严重的疾病损害状态,尤其是早发型子痫前期,因发病孕周早,远离胎儿成熟,病情进展迅速,母儿预后不良。尽管研究者为了明确子痫前期病因,进行了大量工作,其发病机制至今不明,最广为接受的学说是子痫前期患者在妊娠早期滋养细胞着床过浅,子宫螺旋动脉重铸不足导致胎盘缺血缺氧,释放血管损伤因子进入体循环,引起多器官受累,尤以血运丰富器官损伤严重,进而表现出后续临床症状。既往研究主要聚焦于蛋白编码基因,但非蛋白编码基因对基因表达的调控作用越来越受到重视,其中长链非编码RNA在细胞生命活动中具有多种生物学功能,例如可以通过特异结合位点与包括microRNA在内的小RNA结合,阻止其发挥正常作用。长链非编码RNA-GAS5(特异性生长阻滞转录因子5,growth arrest-specific transcript5)已知在多种肿瘤组织和细胞中表达下降,抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡,其调控机制多样,调控靶点各异,主要发挥抑癌作用。已有研究证实,GAS5存在与microRNA-21(miR-21)的特异结合位点,在多种肿瘤组织中,GAS5和miR-21表达呈负相关。GAS5可能通过分子海绵作用,靶向抑制包括miR-21在内的多个microRNA,影响磷脂酰肌醇3-激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)等多种信号通路激活及下游蛋白表达,虽然具体机制不明,但可能与GAS5结合miR-21后,使miR-21形成的RNA诱导沉默复合物(RISC)失活,解除miR-21对包括磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)在内的肿瘤抑制基因的负向调控作用有关,使这些抑癌基因重新发挥抑癌作用,抑制肿瘤生长。在妊娠早期,滋养细胞浸润子宫的过程与肿瘤细胞侵袭转移存在相似的生物学行为,通过分析公共数据库GEO高通量测序结果,我们发现,在子痫前期胎盘组织中存在高表达的GAS5,但样本量少且没有验证试验,目前也尚无有关GAS5参与子痫前期发病的相关研究报道,因此,本研究试图探索GAS5是否在子痫前期,尤其是早发型子痫前期胎盘组织中表达升高,是否与子痫前期病情和母儿不良结局有关,对滋养细胞生物学行为产生怎样的影响,能否通过负向调控miR-21,改变PTEN表达,影响PI3K/AKT信号通路等机制,参与子痫前期发病。研究方法:本研究首先收集40例子痫前期组(其中早发型子痫前期20例,晚发型20例)和32例对照组(其中早发型对照组12例,为前置胎盘合并胎盘谱系疾病,需提前终止妊娠者,晚期正常妊娠20例)的胎盘组织,同时记录临床病例资料,使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各胎盘组织GAS5表达水平,通过t检验比较子痫前期组与对照组临床指标的差异及各组GAS5表达量的差异,并根据Pearson相关性分析判断GAS5表达量与各临床指标间的相关性。根据是否发生母儿不良结局,重新对子痫前期组进行分组,通过t检验评价GAS5水平是否在发生母儿不良结局组存在表达差异。在体外实验中,选取JEG-3和HTR-8/SVneo两种滋养细胞系,构建GAS5过表达和敲降慢病毒表达载体,鉴定表达效率后,通过MTT试验检测细胞增殖能力,Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡,划痕试验检测细胞迁移能力,Matrigel侵袭小室实验检测细胞浸润能力,判断GAS5对滋养细胞生物学行为的影响。进而通过qRT-PCR检测GAS5变化对miR-21表达的影响,并进一步构建miR-21过表达和敲降慢病毒载体,鉴定表达效率,共感染GAS5和miR-21后,qRT-PCR测定GAS5表达能否被miR-21挽救逆转。最后,通过qRTPCR和Western Blot方法检测PI3K/AKT信号通路及其下游基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、TP53能否被GAS5激活,并验证PTEN基因表达量是否与GAS变化相关,以此探索GAS5与子痫前期发病的关系。研究结果:在子痫前期患者胎盘组织中存在高表达的GAS5,尤其以早发型子痫前期表达量最高(P<0.05)。同时子痫前期组多项临床指标与对照组存在显著差异(P<0.05),并且早发型和晚发型分别与其对照组相比,存在差异的临床指标不尽相同,提示子痫前期患者多器官受累,并且早发型与晚发型有不同的疾病特点。GAS5表达水平与凝血酶时间、血浆总蛋白等指标存在较高相关性(0.5<r值<0.8)。但是,GAS5水平与是否发生母儿不良结局无明显联系(P>0.05)。构建GAS5慢病毒过表达和敲降载体成功后,敲降GAS5增强JEG-3和HTR-8/SVneo滋养细胞的增殖能力,反之,过表达GAS5抑制两种细胞增殖(P<0.05);GAS5没有改变细胞的凋亡能力(P>0.05);过表达GAS5降低了两种细胞的划痕后迁移能力,降低了穿透人工基质膜的浸润能力(P<0.05),但是敲降GAS5没有对细胞迁移和浸润造成影响(P>0.05)。进一步探究相关机制,首先检测到miR-21在GAS5敲降时表达量升高,GAS5过表达时表达量下降,miR-21与GAS5变化趋势相反(P<0.05);成功构建miR-21过表达和敲降慢病毒载体后,过表达GAS5和过表达miR-21共转染两种滋养细胞,GAS5表达量会被过表达的miR-21下调,与此相反,共转染敲降载体后,GAS5表达量会被敲降的miR-21上调(P<0.05)。同时,敲降GAS5会使PI3K/AKT信号通路的RNA及蛋白水平均升高,该信号通路激活,而过表达会抑制此通路(P<0.05),这种变化在Western Blot法中更为显著,而且该通路下游的MMP-9、TP53也在通路激活时出现高表达,但因表达量较低,仅在qRT-PCR中得到验证。在滋养细胞中,GAS5没有改变PTEN的RNA及蛋白表达水平(P>0.05)。结论:本研究首次报道lncRNA GAS5与子痫前期发病的关系。1.GAS5在子痫前期尤其是早发型子痫前期胎盘组织中表达升高,早发型与晚发型子痫前期临床特征不完全相同,GAS5与凝血酶时间等凝血功能相关指标及血浆蛋白水平有较高相关性,但与是否发生母儿不良结局无关。2.过表达GAS5抑制JEG-3和HTR-8/SVneo滋养细胞增殖、迁移和浸润能力,但是敲降GAS5仅促进滋养细胞增殖,对迁移、浸润无明显影响;GAS5对滋养细胞凋亡无影响。3.GAS5在滋养细胞系中对miR-21进行负向调控,敲降GAS5可以激活PI3K/AKT信号通路及下游蛋白MMP-9、TP53,过表达GAS5抑制通路及其下游,但MMP-9和TP53的蛋白表达量微弱。GAS5在滋养细胞中不能改变PTEN基因的表达。