随着手性药物的市场需求急剧增长,手性药物及其中间体的制备越来越受到人们的关注。S-3-环己烯-1-甲酸是抗凝血药依度沙班的手性前体物质,因此制备光学纯的S-3-环己烯-1-甲酸具有重要意义。目前其生产方式为化学法手性拆分,但存在操作步骤繁琐且过程中要用到有毒的丙酮试剂等缺点。如能开发可代替化学法的简单高效且绿色环保的生物催化途径,将有助于抗凝血药依度沙班的可持续生产。酯酶BioH是一种能够催化酯键水解的酶,可以不对称水解外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯,得到3-环己烯-1-甲酸。但是野生型酯酶BioH对S-3-环己烯-1-甲酸甲酯的选择性不高(ee_p=32.32%),造成目标产物的合成效率和光学纯度均不理想,因此本论文以S-3-环己烯-1-甲酸的生物催化法制备为目标,通过对酯酶BioH进行分子改造来提高其S-选择性。本文利用计算模拟作为辅助工具,通过分子对接的手段,结合酶蛋白-底物的对接构象对酯酶BioH进行了理性设计,通过调整活性口袋的空间位阻作用、酶和底物间的芳香环作用以及氢键作用来调整其对映体选择性,并在此基础上对最终获得的阳性突变体和野生型酯酶BioH进行了分子动力学模拟,对选择性提高的机理进行了探讨。本文具体的研究内容和实验结果如下:(1)基于对酯酶BioH的结构与催化机理的充分了解,把酯酶BioH与底物进行分子对接,根据两种构型的对映异构体底物与酶对接构象的差异,制定理性设计的策略,构建了9个单点突变,其中有6个为对S-3-环己烯-1-甲酸甲酯选择性提高的阳性突变体,进一步通过组合突变获得最优突变体Mu3(L24A/W81A/L209A),其ee_p值达到了70.92%。(2)可溶性表达分析发现,上述突变体均有包涵体表达的情况,特别是Mu3只有微量的可溶性表达,无法达到反应所需的酶浓度。因此,对突变体的诱导表达条件进行了优化,发现IPTG浓度为0.1 mM、16℃、TB培养基诱导24 h时,可溶性表达效果最佳。(3)为了提高Mu3对底物的催化效率,分别考察了温度、pH、助溶剂种类和浓度对催化反应的影响,最终确定最适温度为30oC、最佳pH为8.0,最适助溶剂为2.5%(v/v)的吐温80,反应条件优化后,Mu3的催化活性达到未优化前的2倍左右。(4)通过对野生型酯酶BioH和优势突变体Mu3进行分子动力学模拟分析,分别从结合能和构象的角度分析了Mu3选择性提高的原因。发现Mu3对R-底物和S-底物的结合能差异高于WT(野生型BioH),因此Mu3对S-底物的选择性提高。但是Mu3对R-底物和S-底物的结合能均高于WT,并且突变后过大的活性口袋不利于底物的结合,因此,Mu3酶活低于WT。