Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)家族的一员,在各种生物中广泛存在,其具有对细胞内多种信号转导通路的调节作用,RKIP在膜的生物合成、精子发生、神经发育和细胞凋亡等生理过程中发挥重要作用,并参与了老年痴呆症及糖尿病等的病理过程。近年来的研究表明RKIP也可以抑制肿瘤细胞的转移。转移是一个复杂的、多步骤的、癌细胞和宿主相互作用的过程。肿瘤细胞从原初肿瘤病灶逃逸,进入循环系统,然后侵袭到一个远距离的组织位点,在该靶位点生长成为一个肉眼可见的肿瘤。抑制转移过程的基因称为转移抑制基因,它并不抑制原初肿瘤的发生。转移抑制基因有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。在肿瘤细胞中,RKIP的异常表达起着至关重要的作用。近年来,研究人员证实RKIP在前列腺癌肿具有抗肿瘤细胞转移的功能。研究人员比较了RKIP在未转移的前列腺癌细胞和已经转移的前列腺癌细胞中的表达水平,实验表明,发生转移的前列腺癌细胞中的RKIP表达水平要低于未发生转移的前列腺癌细胞中的表达水平。免疫组化显示,在正常的和初期的前列腺癌细胞中RKIP表达水平较高。同时,在前列腺癌细胞转移过程中,RKIP的表达下调甚至消失。恢复RKIP蛋白在转移的前列腺癌细胞中的表达可以降低细胞的侵袭性。此外,在小鼠原位注射肿瘤细胞试验中,恢复RKIP的表达可以抑制自发性的肺转移,但不抑制肿瘤细胞的生长。因此,RKIP可以抑制肿瘤细胞的转移,但不抑制肿瘤的发生。RKIP相对分子质量为23 kDa,是包含187个氨基酸残基组成的单链蛋白。免疫组织化学证实RKIP存在于细胞质和质膜。RKIP的晶体结构表明,不同种属的PEBPs具有相似的拓扑结构：中央为一个大的6片层组成p折叠,一侧有一个三片层组成的较小的β折叠,C端有两个位螺旋。在该结构中有一个高度保守的磷酸盐结合袋(phosphate-binding pocket),对PEBP的功能非常重要。在细胞凋亡过程中,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)由细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧,经荧光标记或放射性标记的Annexin V可以特异性结合磷脂酰丝氨酸,与染色质的荧光染料碘化丙啶(PI)联用可以用来检测细胞凋亡。细胞凋亡时细胞膜完整PI无法进入细胞内呈阴性,而标记的Annexin V可以和细胞膜结合呈阳性,区别于细胞坏死时的双阳性。作为细胞膜另一重要组成部分磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)在细胞凋亡时也会翻转到细胞膜外侧。RKIP蛋白在细胞外的功能还没有过多的研究,本实验将利用原核表达系统纯化出RKIP蛋白以及荧光标记的RKIP蛋白,分别用来观察RKIP蛋白在细胞外和肿瘤细胞转移的关系和观察EGFP-RKIP能否像Annexin V,可以检测细胞凋亡。实验最后建立了RKIP的两个变体,分别去掉了N端的β折叠和C端的两个α螺旋,用来观察其对RKIP结构和功能的影响。