据中国CDC数据显示,手足口病(HFMD)自监测以来其报告病例数始终占法定丙类传染病总人数的一半以上。开发有效的抗CVA16病毒感染的疫苗和药物对于公共卫生显得十分迫切,但目前CVA16疫苗尚处于开发研究阶段。本课题旨在初步建立Vero细胞培养肠道病毒CVA16型收获液的分离纯化工艺,以获得高纯度病毒。通过摸索CVA16疫苗大规模纯化的路线及确定纯化的关键工艺参数,为随后CVA16疫苗商业化生产中的纯化工艺奠定基础。采用凝胶层析法对病毒颗粒进行初步纯化,选择分离效果好、回收率高的填料并考察收样时间和收样区域对层析效率的影响。进一步采用离子交换层析法对病毒颗粒进行了精细纯化,选择阴离子交换填料并评价对样品的分离效果。通过对纯化过程中的上样体积和上样流速进行变量分析,优化其最佳层析条件。最后,对纯化的病毒颗粒采用HPLC,Westen-Blotting,SDS-PAGE以及电镜观察等方法进行纯度分析。结果表明:1.初步纯化确定的工艺条件如下:以凝胶B为填料,确定了CVA16抗原存在于第一个流穿蛋白峰中,收样时间为19分钟到30分钟,保留时间为11分钟。连续生产六批CVA16疫苗原液,采用凝胶过滤层析工艺进行纯化的病毒浓缩液的抗原回收率基本稳定,约为40%-50%。2.精细纯化确定的工艺条件如下:采用阴离子凝胶层析,流速为1ml/min,上样量为20%CV时纯化效果最佳。在此工艺条件下,对纯化病毒样品进行收集并检测。结果表明,BSA量均低于检测下限,HPLC检测颗粒峰面积百分比均合格。综上所述,参比中国药典第三部(2015年版)对同类疫苗检定的质量标准,拟定纯化后各组主要检测指标标准如下:(1)杂蛋白检测:牛血清白蛋白含量小于50 ng/ml;(2)纯度检测:HPLC颗粒峰面积百分比大于等于95%。