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环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors, EEDs)能够通过干扰正常机体的内分泌系统从而影响生物体生长、发育、繁殖等生命活动,已成为关系到人类生存和繁衍的热点问题.五氯酚(Pentachlorophenol, PCP)属于优先检测的环境内分泌干扰物之一.它作为一种高效廉价的杀虫剂、木材防腐剂及除草剂曾在世界范围内广泛使用.其在中国长江中下游11个省、市、自治区被大范围、长时间地用作杀灭钉螺和控制血吸虫病,最终进入水体生态系统对水环境造成持久性污染.PCP具有较强的致癌、致畸、致突变作用,对生物体的生殖系统影响较大.PCP对生物体的内分泌干扰作用日益明显,但对其雌激素效应一直存在异议,且PCP内分泌干扰作用具体的分子机制及其可供检测的敏感分子生物标志物研究均较少.稀有鮈鲫为中国所特有的水生模式生物,与斑马鱼等相比具有更好的敏感性和实验重复性,是进行化学品毒性测试和环境水样毒性实验的理想材料.因此,本研究选择稀有鮈鲫为研究对象,采用水体暴露的方式,分别从组织、蛋白、基因水平研究PCP对其卵黄蛋白原的诱导效应以彻底揭示PCP的雌激素效应及其作用机制；同时通过研究PCP对稀有鮈鲫热应激蛋白的诱导效应以筛选敏感、准确的分子生物标志物,对PCP进行有效的监测.研究内容主要包括以下部分：1.为研究VTG在稀有鮈鲫不同组织器官的表达分布情况,以及PCP暴露对不同组织中VTG表达分布的诱导作用,采用半静态水体暴露的方法,将成年雌、雄稀有鮈鲫及幼鱼分别暴露于空白对照组, DMSO溶剂对照组,16、80、160μg·L-1PCP处理组,50ng·L-1EE2阳性对照组中14、21、28d.先利用免疫组化法检测空白对照组中稀有鮈鲫幼鱼和雌、雄鱼体内肝脏、肾脏、脾脏、肠、性腺、大脑、肌肉组织中VTG蛋白的表达分布情况,研究发现VTG蛋白在稀有鮈鲫肝脏细胞中合成,通过血液循环到达其他组织；VTG蛋白只在稀有鮈鲫雌鱼肝脏、肾脏、脾脏、肠组织中有分布,而在其幼鱼和雄鱼各组织中均未见分布.再利用免疫组化检测PCP和EE2暴露对稀有鮈鲫幼鱼和雄鱼肝脏、肾脏、脾脏、肠、性腺、大脑、肌肉组织中VTG的诱导表达情况,研究发现PCP和EE2暴露均能诱导雄鱼和幼鱼肝脏、肾脏、脾脏、肠组织中出现VTG蛋白分布,但PCP效应远弱于EE2,并且其肝脏组织中VTG蛋白的分布与PCP暴露呈浓度效应和时间效应.结果表明稀有鮈鲫幼鱼及雄鱼各组织中VTG的非正常表达分布可以应用于环境雌激素的检测,从组织水平验证了PCP具有雌激素效应.2.采用肝脏组织匀浆和收集血清两种方法结合ELISA技术准确检测不同浓度PCP暴露对雌雄稀有鮈鲫VTG蛋白的诱导量.研究发现40、80、120、160μg·L-1PCP暴露21d能够显著诱导雌雄稀有鮈鲫肝脏和血清中VTG蛋白含量,并具有显著浓度效应(P＜0.01).结果表明稀有鮈鲫肝脏组织匀浆结合ELISA方法同样可以准确检测PCP的雌激素效应.稀有鮈鲫VTG蛋白可以作为PCP检测的分子生物标志物,从蛋白水平说明PCP具有雌激素效应.3.为了解PCP雌激素作用的机制,利用Real-time PCR检测8、16、80、160gg·L-1PCP暴露21d对稀有鮈鲫雄鱼和幼鱼肝脏中雌激素相关关键基因(ERα、ERβ1、ERβ2、VTG Ⅰ、VTG Ⅱ)表达的影响.研究发现,不同浓度PCP均能抑制稀有鮈鲫雄鱼和幼鱼肝脏中ERα基因mRNA的表达(P＜0.05),但诱导ERp1、ERβ2基因mRNA的表达(P＜0.05)；但EE2具有相反的作用,它诱导稀有鮈鲫雄鱼和幼鱼肝脏中ERα基因mRNA的表达(P＜0.01),但抑制ERp1、ERβ2基因mRNA的表达(P＜0.01).同时PCP和EE2都显著诱导VTG Ⅰ、VTG Ⅱ基因mRNA的表达(P＜0.01),但PCP作用远弱于EE2.说明PCP和EE2可能通过调节不同ER基因的表达，进而诱导VTG基因的表达发挥雌激素效应,从基因水平揭示PCP具有雌激素效应.4.利用简并引物和RT-PCR技术从稀有鮈鲫肝脏中克隆得到HSP70和HSP90基因序列片段.HSP70基因片段为1783bp,编码594个氨基酸,提交Genbank得到序列号为：HQ897964；HSP90基因片段为1995bp,编码665个氨基酸,提交Genbank得到序列登录号为：HQ897964.对稀有鮈鲫HSP70和HSP90基因氨基酸序列进行比对发现它们均具有高度保守性；建立系统进化树,发现它们与金丝鱼亲缘关系最近.进行组织表达分析发现稀有鮈鲫HSP70在各组织中均有分布且在鳃和心脏组织中表达量最高,而HSP90基因在除鳍以外组织都有分布,在肝脏组织中表达量最高.稀有鮈鲫HSP70和HSP90基因的克隆为其作为环境内分泌干扰物暴露应激的分子生物标志物研究奠定基础.5.利用Real-time PCR技术检测不同浓度PCP暴露不同时间对稀有鮈鲫肝脏中HSP70和HSP90基因表达的影响.研究发现PCP可以显著诱导稀有鮈鲫HSP70和HSP90基因mRNA的表达,并具有浓度效应和时间效应.8、16、80、160μg·L-1PCP暴露7d, HSP70基因诱导表达随PCP浓度增加而增加,回归方程为：y=0.0408x+1.6692；HSP90基因的诱导表达随着PCP暴露浓度的增加先上升后下降,回归方程为：y=-0.0002x2+0.0311x+1.1563.80μg·L-1PCP暴露0.5、1、3、5、7d, HSP70基因的诱导表达随着PCP暴露时间的增加而增加,回归方程为：y=0.7216x+1.1606；HSP90基因的诱导表达随着PCP暴露时间的增加先上升后下降,回归方程为：y=-0.0917x2+0.8292x+1.0386.说明稀有鮈鲫HSP70和HSP90基因可以作为PCP生物毒性评估和污染早期预警新的分子生物标志物.