【摘 要】
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KRas基因是肿瘤中最常见的原癌基因之一,由其编码的KRas蛋白位于细胞膜内侧,它在传递细胞生长分化信号方面发挥重要作用,参与调节细胞的生长、增殖、凋亡以及迁移等过程,与肿瘤的发生发展密切相关。目前已知约有30%的人类癌症是由于Ras的突变引起的,而其中又有约85%的癌症是因为KRas突变引起的。随着成功靶向KRasG12C突变的共价抑制剂的问世,长达数十年被认为“不可成药”的Ras作为药物靶标再
【基金项目】
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国家自然科学基金（82104199、82173832、81973345）； 临港实验室（LG202103-02-03）；
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KRas基因是肿瘤中最常见的原癌基因之一,由其编码的KRas蛋白位于细胞膜内侧,它在传递细胞生长分化信号方面发挥重要作用,参与调节细胞的生长、增殖、凋亡以及迁移等过程,与肿瘤的发生发展密切相关。目前已知约有30%的人类癌症是由于Ras的突变引起的,而其中又有约85%的癌症是因为KRas突变引起的。随着成功靶向KRasG12C突变的共价抑制剂的问世,长达数十年被认为“不可成药”的Ras作为药物靶标再一次成为研究热点。其中安进公司研发的KRasG12C共价抑制剂AMG510已于2020年由美国食品药品监督管理局（FDA,Food and Drug Administration）批准上市,成为历史上第一个进入临床应用的直接靶向KRas的抑制剂。虽然KRasG12C共价抑制剂不同于传统的ATP竞争性激酶抑制剂,但由于癌症种类和基因背景的不同而产生的原发性耐受以及长期使用导致靶标突变或旁路激活而产生的获得性耐受将限制其临床应用。为研究KRasG12C突变肿瘤细胞对AMG510的耐受机制,我们通过浓度递增法诱导建立了对AMG510耐受的C alu-1 R、MIA Pa Ca-2 R、SW837 R、H23 R细胞,并在Calu-1 R细胞中挑选单克隆Calu-1 C/E作为获得性耐药细胞模型。我们发现构建成功的获得性耐药细胞仍携带KRasG12C突变且对其它两个KRasG12C抑制剂ARS1620和MRTX849交叉耐药,提示该耐药不是由于靶基因的突变引起且具有普遍性。通过分析对比亲本细胞与耐药细胞在AMG510作用下信号通路的变化,我们发现获得性耐药细胞中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路激活程度显著高于亲本细胞,并且能够拮抗AMG510对MAPK和磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）信号通路的抑制作用。受体酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase,RTK）是MAPK和Ras上游重要的细胞信号转导蛋白之一。人类受体酪氨酸激酶磷酸化芯片的实验结果显示,Calu-1C/E细胞中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1,IGF1R）的磷酸化水平较亲本细胞显著升高。在获得性耐药SW837 R和MIAPa Ca-2 R细胞中也观察到类似的现象,提示RTKs的过度激活可能介导KRasG12C突变细胞对该类抑制剂获耐受,并且不同的KRasG12C突变肿瘤细胞产生耐受所依赖的RTK也不相同。通过实时荧光定量PCR,我们发现获得性耐药细胞Calu-1 C/E中生长因子表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和胰岛素样生长因子-1（insulin li ke growth factor,IGF1）的表达量高于亲本细胞,这可能是耐药细胞中RTK显著激活的原因。EGF能够不同程度削弱亲本细胞对AMG510的敏感性,而IGF对AMG510的增殖抑制活性影响较弱。分别抑制EGFR或IGF1R能够显著提高耐药细胞对AMG510的敏感性,而同时抑制EGFR、IGF1R和KRasG12C能够更加彻底地阻断耐药细胞中PI3K和MAPK信号通路以及其克隆形成。通过对系列KRasG12C突变肿瘤细胞的筛查发现细胞中AKT的磷酸化水平与其对AMG510的敏感性呈负相关,提示PI3K信号通路激活可能介导对AMG510的耐受。由于PI3K能够整合来自多种RTK的信号,AMG510长时间作用导致多株KRasG12C突变肿瘤细胞中PI3K信号通路反馈激活,因此抑制PI3K可能增强AMG510的抗肿瘤活性并克服耐药。我们发现PI3Kα抑制剂CYH33与AMG510联用在多数KRasG12C突变的AMG510敏感细胞、原发性耐药细胞以及获得性耐药细胞中协同抑制细胞增殖。CYH33和AMG510联用能够持久抑制上述细胞中PI3K信号通路以及下游蛋白S6的磷酸化。CYH33能够增强AMG510对C alu-1和Calu-1 C裸小鼠移植瘤的生长抑制作用,同时伴随着肿瘤组织中MAPK、PI3K信号通路以及下游S6磷酸化水平的下调。该药物组合对小鼠的体重没有显著性的影响,提示具有较好的安全性。综上所述,我们发现RTKs的激活导致KRasG12C突变细胞对KRas G12C选择性共价抑制剂AMG510产生获得性耐受,而PI3Kα抑制剂CYH33与AMG510联合应用能够克服耐药并协同发挥抗肿瘤活性。以上研究部分解释了对KRas G12C选择性共价抑制产生耐耐受的可能原因,为KRas G12C选择性共价抑制剂和PI3Kα抑制剂联合应用治疗KRas G12C突变的肿瘤提供了理论依据。
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翻译后修饰（Post-translational modifications,PTMs）是指蛋白在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程,通过在特定氨基酸残基上加上修饰基团来改变蛋白质的性质。蛋白质是生命活动的主要承担者,其生物活性的激活及相应功能的发挥都离不开PTMs。常见的PTMs包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、糖基化等。伴随着定量蛋白质组学技术的发展,一些新型的PTMs形式陆续被发现,如赖
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