研究背景肺癌是当今世界上对人类健康危害最大的恶性肺瘤之一,全国肺癌协会最新发布的调查资料显示我国肺癌的发病率已高居各类恶性肿瘤首位。根据肺瘤组织形态学的不同,肺癌主要分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC,包括腺癌、鳞癌和大细胞癌),小细胞肺癌是支气管肺癌中未分癌分型,约占全部肺癌15%,由于较早发生血行转移及淋巴转移,预后极差。虽然小细胞肺癌患者对化疗药物敏感,但由于极易出现多药耐药(multidrug resistance, MDR)而导致治疗失败,而且MDR导致的小细胞肺癌复发率很高,临床预后差,因此,化疗抗药性已成为近年来小细胞肺癌临床治疗急需解决的重要问题之一。锌指转录因子snail超家族由snail、E12/FA7、ZEB1、ZEB2及Slug五个成员组成,参与细胞分化、增殖和凋亡等重要生物过程。研究发现snail基因家族发生异常表达,可导致个体发育和组织器官形成过程中出现异常形态结构,并在前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等恶性肿瘤的发生和发展中起着重要作用,snail家族基因还参与肿瘤细胞耐药和凋亡的调节。研究发现ZEB2在人,大鼠组织中广泛表达,尤其是心脏,神经组织。ZEB2结合E-cad基因启动子区的E-box序列,一直E钙黏蛋白、细胞角蛋白(cytokeratin)、黏蛋白,mac-1和桥粒蛋白的转录。这些蛋白表达的下调,尤其是E钙黏蛋白表达的下调,对于上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)起着非常重要的作用。ZEB2基因作为snail基因家族中的重要成员,与多种肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。研究发现ZEB2与膀胱癌对表皮生长因子抑制剂耐药、卵巢癌对顺铂耐药密切相关。然而,ZEB2基因是否参与小细胞肺癌细胞的凋亡和耐药产生,目前尚无相关报道。MicroRNA (miRNA)是长度为19-25nt的单链非编码核苷酸分子,具有高度的进化保守性,通过对靶mRNA的降解或者翻译抑制,广泛参与动植物细胞的生长发育、分化、增殖与凋亡、激素分泌及肿瘤形成等多种重要生物过程。研究发现miRNA与肿瘤耐药的产生也有着密切的关系。下调niRNA-200c表达,乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性降低。在急性早幼粒细胞白血病中,miRNA-125b的高表达,可增加其对化疗药物的抗药性。在结直肠癌中,上调miRNA-224可增加其对甲氨蝶呤的耐药性。有研究发现非小细胞肺癌(NSCLC)组织中经常发生miRNA-128b杂合性的缺失,miR-128b能够靶向调控表皮生长因子受体,与患者对吉非替尼的敏感性及生存率有关。我们采用miRNA芯片比较分析小细胞肺癌耐药细胞H69AR和非耐药细胞H69中miRNAs的表达差异性,结果发现61个miRNAs出现表达异常,其中miR-375、(?)niR-200b等24个miRNAs表达上调,而miR-100、miR-224等37个(?)niRNAs表达下调,芯片结果得到了实时定量PCR的验证miR-200家族包括miR-200a, miR-200b, miR-200c,miR-141,miR-429五个成员。很多研究表明,miR-200家族靶向两个重要细胞转录抑制因子,即锌指E盒子结合同源框1(Zinc finger E-box-binding homeobox1, ZEB1)和锌指E盒子结合同源框2(Zinc finger E-box-binding homeobox2, ZEB2),调节上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transitions, EMT)及间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transitions, MET),从而影响肿瘤发生、发展、转移、耐药等生物学行为。miR-200b是重要成员之一,生物信息学软件分析发现miR-200b的靶基因多达7000多个。Christoffersen通过原位杂交技术,检测到大鼠大脑中miR-200b与ZEB2mRNA共同表达,上调miR-200b后ZEB2在rnRNA水平和蛋白质水平都下降。我们前期采用基因芯片技术分析ZEB2基因在SCLC多药耐药细胞株H69AR中明显高表达,为进一步明确ZEB2与小细胞肺癌耐药的关系,本实验设想通过RNA干扰技术降低小细胞肺癌细胞多药耐药株H69AR细胞中ZEB2表达,检测转染前后ZEB2在rnRNA及蛋白水平的变化,通过采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK8)法及流式细胞术分析ADM、DDP和VP-16作用H69AR细胞药物敏感性变化及凋亡和周期的变化。对小细胞肺癌组织标本进行分析,明确ZEB2的表达与患者临床病理特征及预后的关系。我们通过生物信息学软件(miRanda和Targetscan软件)预测发现ZEB2是miR-200b其中一个靶基因,miR-200b位于染色体2q22.3的ZEB2簇中间,miR-200b能与ZEB2mRNA的3’-UTR部分配对,因而影响其转录后的翻译过程。前期miRNA芯片显示H69AR中miR-200b在H69AR中明显低表达,与ZEB2的表达呈反向表达关系,提示miR-200b对ZEB2的可能具有靶向调控,本研究还将进一步确定miR-200b与ZEB2基因的调控关系。研究目的比较SCLC多药耐药细胞株(H69AR)和敏感细胞株(H69)中基因表达差异,选取ZEB2基因家族中表达差异显著的成员进行研究,分析其对SCLC I耐药性的调控作用,以及miR-200b对ZEB2基因的调节作用,进一步丰富SCLC多药耐药性的分子机制,为临床治疗提供理论依据。内容与方法一、ZEB2表达对小细胞肺癌多药耐药性的影响采用SiRNA降低H69AR细胞中ZEB2表达,CCK8法分析细胞对小细胞常用化疗药物顺铂(Cisplatin, DDP)、足叶乙甙(Etoposide, VP-16)及阿霉素(Doxorubicin, ADM)敏感性变化,流式细胞术分析细胞凋亡率及细胞周期变化。二、miR-200b对ZEB2的靶向调节作用1、将miR-200b模拟物(mimic)增加H69AR中miR-200b表达水平,实时荧光定量PCR分析miR-200b及ZEB2mRNA水平,Western Blot检测ZEB2蛋白水平的变化。2、构建ZEB23’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)的psiCHECK-2载体(psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR),与miR-200b mimic和inhibitor共转染入H69AR细胞,采用双荧光索酶报告基因测定方法检测ZEB2荧光素酶活性。三、miR-200b对SCLC多药耐药性的影响采用miR-200b mimic增加H69AR、中miR-200b的表达,CCK8法分析细胞药物敏感性的变化,确定miR-200b对SCLC耐药性的影响。四、ZEB2在SCLC组织中的表达及临床病理意义收集68例SCLC患者石蜡包埋组织,免疫组化染色,分析ZEB2表达与SCLC患者临床特征及生存率的关系。五、统计学分析所有结果均经SPSS13.0统计软件进行分析。各实验至少独立重复3次,重复性好。所选图表为3次重复实验的结果之一。所有数据以均数±标准差(x±s、表示,实时定量PCR、western blotting、凋亡及周期实验、荧光素酶活性测定实验采用one-way ANOVA(方差齐时)或近似F检验Welch法(方差不齐)：组间两两比较采用LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。CCK8采用两因素析因设计的方差分析,多重比较用SNK法。同一组内不同浓度间比较和同一浓度不同组间比较用one-way ANOVA。参数比较前均先进行方差齐性检验,若方差不齐用基于方差不齐的近似F检验Welch法。ZEB2表达与临床病理特征的关系分析采用Fisher’s精确分析。ZEB2表达与生存率的关系采用Kaplain-Meier分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。结果一、下调ZEB2的表达显著增加H69AR细胞的药物敏感性1、ZEB2明显降低ZEB2在H69AR细胞中的表达设计合成了三对针对ZEB2的siRNA寡核苷酸,采用lipofectamin2000转染H69AR细胞。三组问mRNA和蛋白表达差异有统计学意义,ZEB2-642组mRNA和蛋白水平较其它两组明显降低(P<0.001)。因此选择ZEB2-642进行后续实验。2、CCK-8法分析结果显示,转染ZEB2-642的H69AR细胞对药物的生存率较阴性对照(negative control, NC)组和空白对照组明显降低(P<0.001),IC50值亦显著降低。3、流式细胞术分析结果显示,ADM、DDP和VP-16处理后,转染ZEB2-642的H69AR细胞的凋亡率较阴性对照组和空白对照组升高,细胞周期发生改变。二、ZEB2是miR-200b的靶基因1、miRNA靶基因预测软件(PicTar,TarScan和miRBase)分析显示, miR-200b与ZEB23’-UTR具有互补结合位点2、miR-200b对ZEB2蛋白表达的调节作用将miR-200b mimic转染H69细胞后,miR-200b表达增加(P<0.001), ZEB2蛋白水平降低(P<0.001),ZEB2mRNA水平无明显变化。3、ZEB2是miR-200b的靶基因(1)成功构建psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR-R载体通过PCR扩增ZEB23’-UTR,产物长度为1512bp,经转化、抗性筛选、挑取单克隆等步骤后试剂盒提取质粒,Not Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,产物大小约为6273bp/1512bp。酶切鉴定psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR克隆1-4和psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR-R克隆3正确,挑起psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR-1号克隆和psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR-R-3号克隆进行测序。测序结果与理论序列一致,试剂盒提取质粒进行后续实验。(2)ZEB2荧光素酶活性受miR-200b mimic和inhibitor调节将psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR-R或psiCHECK-2-ZEB2-3’UTR-mut载体转染入H69AR细胞,共转染miR-200b或inhibitor,检测ZEB2荧光素酶活性发现,与miR-NC组相比,miR-200b可显著抑制转染ZEB23’-UTR的H69AR细胞中ZEB2荧光素酶活性(P<0.001),miR-200b inhibitor可显著增加转染ZEB2的H69AR细胞中ZEB2荧光素酶活性(P<0.001)。miR-200b和miR-200b inhibitor对转染ZEB23’UTR-mut的H69AR细胞中ZEB2荧光素酶活性无影响。三、增加niR-200b表达能降低H69AR细胞对ADM、DDP和VP-16的耐药性转染miR-200b mimic的H69AR细胞对药物的敏感性较阴性对照组和空白对照组增加(P<0.001).IC50值亦降低。四、ZEB2在SCLC组织中的表达与临床病理特征的关系ZEB2阳性表达位于胞核,在SCLC组织中阳性表达率为23.5%(16/68),ZEB2阳性表达率在性别、年龄及生存状态比较无统计学差异(P=0.492,0.776,0.098)。ZEB2在局限期(LD)患者中的阳性表达率为(7.6%)低于广泛期(ED)患者(80.0%),两者的ZEB2阳性表达率具有统计学差异(P<0.001)。五、SCLC患者生存分析Kaplan-Meier法分析患者生存率,结果发现男性患者与女性患者的生存率无统计学差异(P=0.152)。不超过57岁的患者与高于57岁以上患者生存率无统计学差异(P=0.097)。局限期患者的生存率高于广泛期患者,具有统计学差异(P<0.001)。ZEB2阴性患者的生存率高于ZEB2阳性患者,具有统计学差异(P<0.001)。结论1、ZEB2在SCLC多药耐药株H69AR中农达增加,下调ZEB2能够降低H69AR细胞对ADM、DDP、VP-16等化疗药物的耐药性,表明ZEB2参与了SCLC的多药耐药。2、miR-200b在SCLC多药耐药株H69AR中表达降低,通过ZEB23’-UTR调节ZEB2的表达,上调miR-200b可使H69AR细胞对ADM、DDP、VP-16等化疗药物的耐药性降低,ZEB2是miR-200b的靶基因之一,表明miR-200b参与了对ZEB2的表达调控及SCLC的多药耐药过程。3、ZEB2在SCLC组织中的阳性表达与患者的分期和生存率有关,可以作为SCLC患者的临床预后指标。